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A utilização de phasor plots tem sido uma ferramenta poderosa no estudo de sistemas fluorescentes complexos, como exemplificado pelo estudo do peptídeo Sit1, que se liga a micelas de HPS. O uso dessa abordagem permite a visualização detalhada da interação entre moléculas, como a mudança dos pontos de phasor durante a titulação do Sit1. A transição entre os estados livre e ligado da molécula é facilmente observada a partir da modulação da frequência, como ilustrado nas figuras que mostram os pontos de phasor ao longo do processo de titulação. A análise geométrica desses pontos, que se distribuem ao longo da hipotenusa de um triângulo retângulo, pode ser utilizada para gerar a isoterma de ligação de Bjerrum, fornecendo insights sobre as interações moleculares a partir de simples cálculos trigonométricos.
Outro exemplo do uso de phasores é no estudo de FRET (Transferência de Energia por Ressonância Fluorescente), que será abordado em detalhes no capítulo 9. A observação de pontos de phasor para um fluoróforo atuando como doador de energia em um sistema FRET revela uma diminuição na sua vida útil devido à transferência de energia para o aceitador. Quando o doador apresenta um decaimento monoexponencial, seus pontos de phasor se movem ao redor do círculo universal, à medida que a eficiência do FRET aumenta. Esse movimento reflete a dinâmica do sistema e permite uma análise precisa da eficiência da transferência de energia.
Contudo, se o sistema não apresentar um decaimento monoexponencial, como ilustrado por um fundo fluorescente, os pontos de phasor não seguirão uma trajetória simples. Em vez disso, eles se deslocarão em direção ao ponto do fundo, à medida que a contribuição deste para o sinal total aumenta, o que deve ser cuidadosamente analisado para evitar interpretações equivocadas. Além disso, se a fluorescência do aceitador for observada, seus pontos de phasor podem cair fora do círculo universal, indicando que ocorreu um atraso adicional no estado excitado, o que é uma clara evidência da ocorrência de FRET.
O uso de phasores também se estende a outros tipos de experimentos, como a análise de processos de relaxação dipolar em sistemas de membranas. Por exemplo, no estudo com LAURDAN, um marcador fluorescente, a observação dos pontos de phasor revelou que processos de relaxação ocorreram devido à interação com as moléculas de água nas cabeças dos fosfolipídios. Esses processos não podem ser descritos por modelos exponenciais tradicionais, mas os phasors oferecem uma abordagem alternativa que facilita a interpretação desses dados complexos. Nos experimentos com sistemas de DNA, como o estudo de Buscaglia et al. (2012), a análise de phasors foi crucial para entender mudanças conformacionais em estruturas nucleotídicas, como as formadas por G-quadruplexos, em resposta à substituição de íons contrários.
A técnica de phasor plots também pode ser aplicada na análise de enzimas e proteínas, como demonstrado por Tian et al. (2015), ao estudar a fosfofrutoquinase (PFK) de Thermus thermophilus. Neste estudo, a mutação de resíduos de triptofano e o monitoramento dos pontos de phasor ajudaram a entender os efeitos da ligação do ligante na proteína, oferecendo uma visão detalhada de seus estados conformacionais e da interação com ligantes como o PEP e o Fru-6-P. O uso de phasors neste caso ajudou a definir se o modelo de ligação de ligantes da proteína seria melhor descrito por uma abordagem de dois estados ou por um modelo termodinâmico mais complexo.
Portanto, ao aplicar a análise de phasor em sistemas fluorescentes, é possível observar mudanças sutis no comportamento das moléculas e entender melhor fenômenos como FRET, relaxação dipolar e transições conformacionais. Essas observações permitem uma caracterização mais detalhada dos processos biofísicos, proporcionando um melhor entendimento de interações moleculares em nível subcelular.
Qual é a origem e importância histórica da fluorescência, desde a madeira de Lignum nephriticum até os primeiros estudos científicos?
A madeira de Lignum nephriticum, especialmente popular na Europa dos séculos XVI e XVII, tornou-se famosa principalmente por suas virtudes medicinais no tratamento de doenças renais. Durante essa época, a madeira era amplamente comercializada, sendo valorizada não apenas por suas propriedades curativas, mas também por um fenômeno intrigante: sua fluorescência. No entanto, ao longo dos séculos, o conhecimento sobre a espécie que a produzia foi se perdendo, e a madeira desapareceu das prateleiras europeias, sendo confundida com outras espécies. Interessantemente, ainda é possível encontrá-la em mercados de rua no México, onde continua sendo utilizada para fins medicinais. O estudo e a identidade botânica dessa madeira foram recuperados em 1915 por W.E. Safford, que identificou a planta responsável pela Lignum nephriticum como sendo Eynsemhardtia polystachia, desvendando assim o enigma da sua composição botânica.
Safford documentou seus achados em um estudo importante, "Lignum Nephriticum – Sua História e o Relato da Fluorescência Notável da Infusão", publicado no Relatório Anual do Smithsonian Institute em 1915. Mais tarde, em 1982, um grupo de pesquisadores isolou compostos altamente fluorescentes da planta, os glucosídeos-hidroxicalconos. No entanto, foi apenas em 2009 que um estudo de A. Ulises Acuña e seus colegas em Madrid esclareceu a origem do tom azul observado pelos astecas na madeira: a conversão do composto coatline B em matlaline, que emite uma luz azul intensa sob condições levemente alcalinas. Essa substância, que leva o nome de "matlali", que significa azul na língua asteca, possui uma emissão máxima de 466 nm, com um rendimento quântico próximo da unidade, o que significa que praticamente cada fóton absorvido gera um fóton fluorescente.
O fenômeno que envolvia a madeira de Lignum nephriticum atraiu a atenção de muitos estudiosos da época. O polímata jesuíta alemão Athanasius Kircher, em seu livro de 1646 "Ars Magna Lucis et Umbrae" (A Grande Arte da Luz e da Sombra), descreveu suas observações sobre a madeira. Ele notou que a luz que passava por uma infusão aquosa da madeira aparecia amarela, enquanto a luz refletida da solução era azul, o que causou grande surpresa na época. Essa descoberta gerou discussões sobre o papel de Kircher na história da fluorescência, embora o título de "Pai da Fluorescência" devesse, na verdade, ser atribuído a outro.
Isaac Newton também investigou a Lignum nephriticum, e Robert Boyle, inspirado pelos estudos de Monardes, aprofundou suas observações sobre o fenômeno. Em 1664, Boyle publicou um trabalho na Royal Society intitulado "Experimentos e Considerações sobre Cores", onde discutia como a madeira perdia sua capacidade de tingir a água após várias infusões. Ele também descobriu que a adição de um ácido fazia com que a cor desaparecesse, enquanto a adição de uma base restaurava a cor, permitindo a Boyle utilizar a fluorescência como um indicador de pH. Isso foi uma contribuição pioneira para o estudo das reações químicas envolvendo mudanças de pH.
O estudo da fluorescência continuou a se expandir ao longo do tempo, com importantes descobertas como a de David Brewster em 1833, que observou a fluorescência da clorofila ao passar luz branca por uma solução alcoólica de folhas. No entanto, foi em 1845 que John Herschel fez uma observação crucial sobre a fluorescência do quinino, fenômeno que ele chamou de "dispersão epipólica". Ele descreveu a cor azul intensa que o quinino emitia quando iluminado por luz ultravioleta, um fenômeno que podemos verificar hoje ao iluminar a água tônica com uma lâmpada UV. O quinino, utilizado no tratamento da malária, levou à criação do famoso coquetel gin tônica, que, curiosamente, foi inventado pelos oficiais britânicos na Índia para tornar o quinino mais palatável.
Porém, é George Gabriel Stokes quem deve receber o título de "Pai da Fluorescência". Em 1853, Stokes publicou um trabalho fundamental intitulado "Sobre a Mudança de Refrangibilidade da Luz", onde postula que a fluorescência do quinino não é causada pela reflexão ou refração da luz, mas pela absorção de luz seguida pela emissão de uma cor diferente. Ele introduziu o conceito de "deslocamento de Stokes", uma mudança no comprimento de onda da luz emitida em relação à luz excitadora. Esse fenômeno é a base para o entendimento moderno da fluorescência, e a partir dele, o termo "fluorescência" foi cunhado, inspirado no mineral fluorspar, que também exibe esse tipo de emissão luminosa.
Além disso, o conceito de fluorescência tornou-se fundamental para o desenvolvimento de diversas tecnologias modernas, como a espectrofotometria, as lâmpadas fluorescentes e até a observação da concentração de clorofila em satélites orbitando a Terra. A fluorescência, que antes era um fenômeno misterioso e de interesse puramente científico, agora é utilizada em uma variedade de aplicações cotidianas e industriais, revelando a profundidade da sua importância no avanço da ciência e da tecnologia.