Jakie są techniki kalibracji i jak wybrać odpowiednią metodę w zależności od rodzaju analizy?

W chemicznych analizach ilościowych, kalibracja stanowi jeden z kluczowych etapów, zapewniających dokładność i wiarygodność wyników. Zasadniczo, kalibracja polega na ustaleniu zależności między sygnałem pomiarowym a stężeniem analizowanego składnika. Istnieje kilka metod kalibracji, z których każda ma swoje specyficzne zastosowanie i zalety. W tej części omówimy trzy główne techniki kalibracji: metodę pojedynczego standardu, metodę z próbkami bracketingowymi oraz metodę kalibracji za pomocą krzywej kalibracyjnej. Każda z nich oferuje różne podejścia i może być stosowana w zależności od charakterystyki próbek oraz wymagań analizy.

$Cx = Cst \times \frac{Sx}{Sst}$

gdzie:

• $Cx$ – stężenie analitu w próbce testowej,

• $Cst$ – stężenie analitu w próbce standardowej,

• $Sx$ – sygnał pomiarowy próbki testowej,

• $Sst$ – sygnał pomiarowy próbki standardowej.

Ta technika jest bardzo szybka i skuteczna, pod warunkiem, że różnice w sygnałach między próbką testową a standardową nie są zbyt duże. Przykład zastosowania tej metody przedstawiono poniżej:

Przykład: Na podstawie wyników pomiarów dla próbki standardowej i próbki testowej, stężenie analitu w próbce testowej obliczamy jako:

Jest to dość prosta metoda, która sprawdza się, gdy sygnały dla próbek standardowych i testowych są dobrze zróżnicowane.

Metoda próbek bracketingowych jest bardziej zaawansowaną techniką, która polega na pomiarach na trzech próbkach: jednej próbce testowej, jednej próbce standardowej, w której stężenie analitu jest wyższe od stężenia w próbce testowej, oraz jednej próbce standardowej, w której stężenie analitu jest niższe. Ta metoda pozwala na bardziej precyzyjne wyliczenia, szczególnie w przypadkach, gdy stężenia analitu są bliskie wartościom granicznym. Wzory wykorzystywane do obliczeń w tej metodzie są następujące:

gdzie:

• $Cx$ – stężenie analitu w próbce testowej,

• $Cst_H$ – stężenie analitu w próbce standardowej, w której stężenie jest wyższe niż w próbce testowej,

• $Cst_L$ – stężenie analitu w próbce standardowej, w której stężenie jest niższe niż w próbce testowej,

• $Sx$ – sygnał pomiarowy próbki testowej,

• $Sst_H$ – sygnał pomiarowy próbki standardowej o wyższym stężeniu,

• $Sst_L$ – sygnał pomiarowy próbki standardowej o niższym stężeniu.

W tej metodzie, im mniejsza różnica między stężeniami w próbkach standardowych, tym dokładniejszy wynik, co sprawia, że technika ta jest preferowana, zwłaszcza w przypadku niestabilnych pomiarów. Przykład obliczeń:

Przykład: Na podstawie wyników pomiarów dla próbek standardowych i testowej obliczamy stężenie analitu w próbce testowej:

Metoda kalibracji za pomocą krzywej kalibracyjnej to najbardziej zaawansowana technika, która pozwala na uzyskanie najlepszego dopasowania między sygnałami pomiarowymi a stężeniami analitu. W tej metodzie wykorzystuje się co najmniej pięć próbek standardowych o różnych stężeniach, które obejmują oczekiwany zakres stężenia analitu w próbce testowej. Następnie, na podstawie zmierzonych sygnałów i znanych stężeń, tworzy się krzywą kalibracyjną. Do obliczenia stężenia analitu w próbce testowej wykorzystuje się metodę regresji liniowej, która daje funkcję zależności sygnału od stężenia. Wzór dla krzywej kalibracyjnej to:

gdzie:

• $S$ – sygnał pomiarowy,

• $b$ – współczynnik kierunkowy (nachylenie),

• $C$ – stężenie analitu,

• $a$ – wyraz wolny (przecięcie z osią y).

Po obliczeniu współczynników $b$ i $a$, stężenie analitu w próbce testowej oblicza się za pomocą wzoru:

Przykład: Na podstawie wyników pomiarów dla siedmiu próbek standardowych i próbki testowej obliczamy stężenie analitu w próbce testowej. Po przeprowadzeniu obliczeń, uzyskujemy wartość:

$Cx = 17.3 \, \text{mg/dm}^3$

Krzywa kalibracyjna jest szczególnie przydatna, gdy zależność między stężeniem a sygnałem jest nieliniowa lub gdy mamy do czynienia z szerokim zakresem stężeń.

Porównanie wyników uzyskanych różnymi metodami kalibracji pokazuje, że dla próbek o podobnym stężeniu analitu, wyniki uzyskane za pomocą różnych technik kalibracji mogą być zbliżone. Przykładowo, w przypadku trzech opisanych technik – pojedynczego standardu, próbek bracketingowych i krzywej kalibracyjnej – wyniki obliczeń stężenia analitu w próbce testowej wyniosły odpowiednio 17.6, 17.7 i 17.3 mg/dm³, co wskazuje na brak istotnych różnic w precyzji tych metod w przypadku dobrze dobranych próbek i odpowiednich zakresów stężeń.

Ważne jest, aby przy wyborze metody kalibracji wziąć pod uwagę kilka kluczowych czynników. Po pierwsze, jeśli różnice między stężeniami w próbkach standardowych są małe, lepszym wyborem będzie metoda bracketingowa lub metoda kalibracji za pomocą krzywej. W przypadku dużych różnic w sygnałach, metoda pojedynczego standardu może być wystarczająca. Po drugie, dla dokładniejszych pomiarów warto stosować metodę krzywej kalibracyjnej, szczególnie gdy analizowane próbki mają szeroki zakres stężeń lub gdy zależność między stężeniem a sygnałem jest nieliniowa.

Jak prawidłowo określić LOD i LOQ oraz zweryfikować ich poprawność w analizie jakościowej?

Określenie granicy detekcji (LOD) i granicy oznaczalności (LOQ) jest jednym z fundamentalnych etapów walidacji metody analitycznej, mającym na celu ustalenie minimalnego stężenia analitu, które może być wykryte (LOD) lub oznaczone z zadowalającą precyzją (LOQ). Proces ten opiera się na statystycznej analizie wyników pomiarów standardowych roztworów oraz próbek wzorcowych, a także na weryfikacji zgodności wyznaczonych wartości z rzeczywistymi wartościami stężeń.

W praktyce obliczenia LOD i LOQ często wykorzystują odchylenie standardowe serii pomiarów niskostężeniowych roztworów oraz współczynnik t-Studenta, który uwzględnia poziom ufności (zwykle α = 0,05). LOD najczęściej oblicza się ze wzoru LOD = 0 + 3×SD, gdzie SD oznacza odchylenie standardowe wyników pomiarów blanków lub bardzo rozcieńczonych próbek. Z kolei LOQ wyznacza się zwykle jako 10-krotność odchylenia standardowego lub na podstawie stosunku sygnału do szumu (S/N), przy czym wartości S/N mieszczące się w zakresie od 3 do 10 uznaje się za akceptowalne dla LOD.

Weryfikacja LOD i LOQ może być także przeprowadzana metodą graficzną, gdzie sygnał analityczny jest wykreślany w funkcji stężenia. Wykres kalibracyjny powinien wykazywać liniowość, a odchylenia standardowe sygnału (SD) i regresji (SDa, SDxy) są kluczowe przy obliczeniach. Wartości LOD wyliczane na podstawie parametrów kalibracji, takich jak nachylenie prostej (b) czy odchylenia resztkowego, powinny być spójne z wcześniejszymi metodami i potwierdzać stabilność oraz wiarygodność metody.

Przy ustalaniu LOQ istotne jest także zwrócenie uwagi na precyzję metody mierzoną współczynnikiem zmienności (CV). Przyjmuje się, że maksymalna akceptowalna wartość CV wynosi 5%, co świadczy o dostatecznej powtarzalności pomiarów. W praktyce, wyznaczona LOQ wskazuje dolną granicę zakresu pomiarowego metody, natomiast zakres liniowości obejmuje stężenia od LOQ do najwyższego poziomu, dla którego sygnał nadal rośnie proporcjonalnie do stężenia analitu.

Ważne jest, by podczas wyznaczania LOD i LOQ odpowiednio dobierać i przygotowywać próbki wzorcowe, a także prowadzić wielokrotne pomiary w celu uzyskania wiarygodnych statystyk. Przeprowadzenie walidacji metody w sposób systematyczny i uwzględniający różne metody obliczeń minimalizuje ryzyko błędów i zwiększa zaufanie do uzyskanych wyników analitycznych.

Ponadto należy pamiętać, że LOD i LOQ są charakterystyczne dla konkretnej metody i warunków pomiarowych — zmiana sprzętu, odczynników czy parametrów analizy może wymagać ponownej walidacji tych wartości. Zrozumienie i prawidłowe zastosowanie tych pojęć ma fundamentalne znaczenie dla jakości i rzetelności badań analitycznych, zwłaszcza w dziedzinach wymagających precyzyjnej detekcji śladowych ilości substancji, takich jak kontrola jakości, analizy środowiskowe czy badania farmaceutyczne.

Jak obliczyć wartości LOD, LOQ, powtarzalność i dokładność w metodach analitycznych?

Analiza metod walidacyjnych, zwłaszcza w kontekście oznaczania zawartości rtęci w próbkach, wiąże się z wieloma trudnościami, które muszą zostać przezwyciężone, aby uzyskać precyzyjne i wiarygodne wyniki. W niniejszym rozdziale omówione zostaną kluczowe etapy walidacji metod analitycznych, obejmujące wyznaczanie wartości LOD (limit detekcji), LOQ (limit oznaczalności), powtarzalności oraz dokładności, a także oszacowanie niepewności pomiarowej.

Wartość LOD jest fundamentalnym parametrem w każdej metodzie analitycznej, określającym najniższą ilość substancji, którą metoda jest w stanie wykryć z odpowiednią pewnością. Dla wyznaczenia LOD posługujemy się równaniem:

gdzie $S$ to standardowe odchylenie reszt, a $b$ to nachylenie krzywej kalibracyjnej. Wartość ta można obliczyć dla różnych źródeł błędów, takich jak błąd resztowy (SDxy) czy błąd nachylenia krzywej kalibracyjnej (SDb), a także dla średnich wyników. Przykład obliczeń, który przeprowadzono, wykazuje, że wartość LOD dla różnych przypadków może wynosić od 2.0 ng do 2.9 ng. Ważnym krokiem w procesie weryfikacji poprawności wyznaczenia LOD jest porównanie obliczonego wyniku z minimalną wartością stężenia substancji, którą metoda jest w stanie wykryć (w tym przypadku wynoszącą 20 ng).

Drugim kluczowym parametrem jest LOQ, czyli limit oznaczalności, który jest zależny od LOD i można go obliczyć za pomocą wzoru:

Na podstawie tego wzoru oblicza się wartość LOQ, która w naszym przypadku wynosi 7.4 ng. Wartość ta wskazuje na zakres, w którym metoda może nie tylko wykrywać, ale i dokładnie określać ilość substancji, z odpowiednią pewnością. Zakres oznaczalności w tym przypadku wynosi od 7.4 ng do 100 ng.

Kolejnym parametrem istotnym w procesie walidacji jest powtarzalność metody. Oblicza się ją na podstawie serii wyników uzyskanych dla różnych próbek, sprawdzając czy występują odchylenia od wartości średniej. Do wykrywania wartości odstających z serii wyników używa się testu Dixona Q, który pomaga stwierdzić, czy w zestawie wyników pojawiają się anomalie. W przypadku analizowanych próbek (mięso kormorana) test Dixona wykazał brak wyników odstających.

Po usunięciu wyników odstających, dla oceny powtarzalności należy obliczyć współczynnik zmienności (CV) dla poszczególnych próbek. W analizie trzech próbek mięsa kormorana wartość powtarzalności obliczono jako średnią wartość CV, która w przypadku omawianych próbek wynosi 4.24%. Test Hartleya Fmax, służący do analizy jednorodności wariancji, wykazał, że dla trzech próbek nie występują istotne różnice w wariancji, co pozwala na obliczenie średniego współczynnika zmienności.

W procesie walidacji metody analitycznej bardzo istotne jest także obliczenie niepewności pomiarowej, która może pochodzić z różnych źródeł: błędu kalibracji, powtarzalności wyników czy dokładności oznaczenia. Aby oszacować całkowitą niepewność, oblicza się tzw. budżet niepewności, który uwzględnia wszystkie te składowe. Dla próbek analizowanych w przedstawionym przypadku, całkowita niepewność pomiaru nie przekroczyła 10%, co jest akceptowalnym wynikiem w kontekście analitycznym.

Ważnym krokiem w procesie walidacji jest także opracowanie szczegółowego raportu, który zawiera nie tylko wyniki analizy, ale również pełną dokumentację metody, procedury kalibracji, użytych odczynników oraz urządzeń pomiarowych. Raport ten powinien obejmować również specyfikację bezpieczeństwa, harmonogram przeprowadzenia metodologii w warunkach rutynowych oraz analizę statystyczną wyników.