Hvordan kan nær-infrarød fluorescensavbildning (NIR FLI) forbedre kreftbehandling og protein-interaksjonsmåling?

Nær-infrarød fluorescensavbildning (NIR FLI) har de siste årene blitt et viktig verktøy innen medisinsk forskning, spesielt i prekliniske studier. Den raske anskaffelseshastigheten og kontrastintensiteten generert gjennom radiometrisk måling gir bedre vevskarakterisering. Når det gjelder monoeksponentiell nedbrytning, kan tilpasning/phasoranalyse brukes for å hente ut fluorescensens levetid. Når flere fluoroforer benyttes, kan flere gates og eksponentielle tilpasnings- eller phasoranalyseteknikker benyttes for å beregne multipel eksponentiell levetid.

Fluorescensens levetid mikroskopi (FLIM) har vært brukt i en rekke metodiske applikasjoner som kontrastforbedring og multiplexing. FLIM har også blitt brukt til å kvantifisere protein-protein interaksjoner, visualisere morfologi av intracellulære strukturer, estimere absolutte membranpotensialer, og måle pH samt andre cellulære prosesser. Den viktigste fordelen med FLI er dens anvendbarhet på tvers av forskjellige bildeteknologier og skalaer, fra mikroskopiske til makroskopiske undersøkelser.

Et viktig skritt videre er integreringen av NIR FLI med optisk avbildning for å implementere makroskopisk NIR fluorescensavbildning (MFLI) i levende organismer, spesielt for in vivo analyse av tumorer. MFLI gjør det mulig å få molekylær informasjon relatert til tumormorfologi, pH-nivåer, enzymatisk aktivitet, legemiddel-målinteraksjoner, samt vaskularitet i intakte tumor-xenograft-modeller. Dette er mulig fordi NIR-lys, som har en bølgelengde på over 700 nm, gir høyere signal-til-støy-forhold, økt dybdepenetrasjon og reduserte lysdempningseffekter i vevet. NIR-området, som strekker seg fra 700 til 1000 nm, gjør det mulig å fange spesifikke signaler fra dyptliggende svulster, samtidig som multiplexing av bilder kan gjennomføres.

Når det gjelder NIR MFLI, kan to hovedmetoder benyttes: fluorescensreflektansavbildning og fluorescensmolekylær tomografi (FMT). Fluorescensreflektansavbildning fanger 2D-bilder direkte fra et tidsoppløst kamerasystem eller et raster-scanningsystem. På den annen side krever FMT flere målinger fra forskjellige vinkler av prøven for å løse et invers problem og hente ut 3D-biodistribusjonen av fluoroforene. FMT kan også utføres i refleksjonsmodus for grunne vev eller i transmisjonsmodus for dyptliggende svulster.

En annen viktig anvendelse av NIR FLI er Forster Resonance Energy Transfer (FRET)-teknologi. FRET skjer når en donorfluorofor-lablert protein er i nærheten av en acceptorfluorofor-lablert protein (i området 2–10 nm), og det skjer en ikke-radiativ energioverføring mellom dem. Denne energioverføringen gjenspeiler den nære nærheten mellom donor- og acceptorproteiner og gir innsikt i endringer i cellulære og molekylære prosesser, som for eksempel protein-protein interaksjoner, reseptordimerisering, protease-indusert proteinspalting, samt biosensorer for pH, ioner og kinaser.

FLI har vist seg å være en av de mest robuste metodene for å kvantifisere FRET-hendelser, både in vitro og in vivo, ved å måle reduksjonen i fluorescensens levetid for donorfluoroforen når den er nær acceptorfluoroforen. FRET-hendelser fører til slukking av donorfluorescens, noe som resulterer i en reduksjon i kvantelyset og levetiden til donorfluoroforen. Denne reduksjonen i levetid kan brukes til å beregne energioverførings effektiviteten (E), som kan uttrykkes ved formelen E = 1 − τDA/τD, der τDA er donorens levetid i nærvær av acceptoren og τD er donorens levetid uten acceptor.

I prekliniske tumor-modeller har NIR FLI FRET blitt brukt til å kvantifisere antistoffmål-engasjement, særlig for membranreseptorer som overuttrykkes i kreftceller. Disse reseptorene regulerer nøkkelprosesser som celleproliferasjon, differensiering, og celledeling. Antistoffer rettet mot disse reseptorene har blitt viktige verktøy i kreftbehandling, ettersom de er spesifikke og har færre bivirkninger. I dag er disse antistoffbaserte terapiene en del av standardbehandlingen for prostatakreft, brystkreft, samt hode- og halskreft.

Imidlertid kan utvikling av resistens mot antistoffbaserte behandlinger føre til behandlingssvikt, og dermed økt dødelighet. Derfor er det nødvendig med kvantitative bildemetoder som kan skille effektivt legemiddel-mål-engasjement og gi innsikt i mikro-miljøfaktorene som påvirker levering av terapeutiske antistoffer. Før utviklingen av FLI-metodene ble slik binding kun evaluert gjennom invasive biokjemiske og immunhistokjemiske metoder.

NIR FLI FRET-teknologi gir et svært presist og ikke-invasivt verktøy for å overvåke protein-protein interaksjoner, og spesielt for å kvantifisere antistoff-reseptorbindinger i prekliniske kreftmodeller. Dette kan forbedre både forståelsen av behandlingsresponsen og bidra til mer målrettet terapi.

Hvordan kan man effektivt berike og analysere tumor-EV mRNA for kreftdiagnostikk?

Berikelse og analyse av tumor-ekstracellulære vesikler (EV) med fokus på mRNA har vist seg å være en lovende metode for tidlig kreftdiagnostikk og behandlingsovervåking. EVs, som frigjøres fra tumorceller, inneholder biomolekyler som mRNA, som kan reflektere tumorens genetiske profil og dermed gi verdifull informasjon om sykdomsstatus. Et sentralt problem har vært å isolere og berike tumor-EV med høy spesifisitet, spesielt fordi slike vesikler finnes i svært små mengder i blodet og andre kroppsvæsker.

En ny tilnærming utnytter «click chemistry» for å merke og fange opp tumorspesifikke EVs. Dette gjøres ved å koble TCO (trans-cyclooctene)-graftede antistoffer eller lipidmolekyler til overflateproteiner eller lipidmembranen til EVs. For tumor-EV uten kjente overflateproteiner, kan lipidbaserte TCO-konjugater som DSPE-PEG1000-TCO inkorporeres i membranen og gi en universell merkemekanisme. Metoden reduserer biologiske forstyrrelser som ofte oppstår ved streptavidin-biotin-baserte metoder, noe som øker spesifisiteten i berikelsen.

Etter berikelse kan mRNA-profilering utføres med høysensitive teknikker som RT-digital PCR eller RT-droplet digital PCR. Disse metodene tillater nøyaktig kvantifisering av mRNA, også når mengdene er svært lave. Selv om neste generasjons sekvensering (NGS) gir omfattende data, er digital PCR mer kostnadseffektivt og raskere, og egner seg derfor godt for kliniske analyser der et begrenset panel av mRNA-mål er tilstrekkelig.

Bruk av tumor-EV-mRNA for mutasjonsdeteksjon har allerede vist lovende resultater innen flere kreftformer som pankreaskreft og glioblastom, med høy sensitivitet og sterk korrelasjon til kliniske utfall. Ved å fokusere på tumorspesifikke mRNA-markører som reflekterer vevsopprinnelse, eksempelvis markører for leverkreft (HCC) eller prostatakreft (PCa), kan man ikke bare påvise kreft, men også verifisere hvilken type tumor EVs stammer fra. Dette kan gjøres uten behov for individuell tumorsekvensering, noe som øker anvendbarheten for ulike solider svulster.

For å oppnå dette kreves en effektiv to-trinns arbeidsflyt: først berikelse av EV ved hjelp av click chemistry, deretter mRNA-kvantifisering med digitale PCR-metoder. Slik kan man få fram detaljerte mRNA-profiler som inkluderer onkogene mutasjoner og tumorspesifikke uttrykk, egnet for diagnostiske formål og monitorering av tumorbelastning.

Cellinje-deriverte EV-modeller brukes ofte for å teste og validere disse metodene, med nøye kontrollert isolasjon og rensing for å sikre at man analyserer rent tumorrelatert materiale. Kombinasjonen av spesifikke antistoffer, click chemistry og digital PCR gir dermed en kraftfull plattform for utvikling av nye liquid biopsy-baserte kreftdiagnostiske verktøy.

Det er avgjørende å forstå at den kliniske anvendelsen av denne teknologien krever en grundig karakterisering av både EVs og deres mRNA-innhold, samt utvikling av standardiserte protokoller for prøvehåndtering, berikelse og analyse. Sensitiviteten og spesifisiteten til metoden gjør den egnet til å fange opp minimale restsvulster eller tidlige stadier av sykdom som tradisjonelle biopsier ikke kan påvise. Videre bør man være oppmerksom på at tilpasning av antistoffpaneler og lipidmerker må gjøres ut fra tumorens molekylære profil for å sikre optimal fangst av relevante EV-fraksjoner.

Kunnskap om tumorbiologi og EV-dynamikk er også viktig for å tolke data fra mRNA-profilering riktig, da EV-frigjøring kan variere mellom tumorstadier og under behandling. Forståelsen av hvordan tumor-EV mRNA endres over tid kan gi innsikt i sykdomsprogresjon og respons på terapi, noe som gjør denne teknologien til et verdifullt verktøy i presisjonsmedisin.

Hvordan Genomiske Metoder Bidrar til Risikostratifikasjon og Behandlingsstrategier ved Multiple Myelom

I behandlingen av multiple myelom (MM) har fremveksten av genomiske og transkriptomiske metoder åpnet nye muligheter for mer presise og personlige tilnærminger. Denne utviklingen har ikke bare forbedret forståelsen av sykdommens genetiske landskap, men har også vært avgjørende for å skape mer målrettede behandlingsstrategier og risikovurderinger. Ved å integrere DNA- og RNA-sekvensering, sammen med sofistikerte analysemetoder, er det mulig å bygge en helhetlig forståelse av sykdommens biologi på et individuelt nivå.

Den første fasen i genetiske analyser starter med sekvensering av både tumor- og normale prøver, hvor lesedataene blir justert mot referansegenomet. Dette skjer gjennom Burrows-Wheeler Aligner, etterfulgt av videre bearbeiding og raffinering ved hjelp av verktøy som GATK for å rette opp inkonsistenser og duplikasjoner i dataene. Målet er å forberede informasjonen for presis identifikasjon av genetiske variasjoner, som både kan gi innsikt i tumorens sammensetning og dens mutasjonsprofil.

Når det gjelder identifisering av germline-varianter, benyttes en haplotypetilnærming som deretter følges av scoring og filtrering for å sikre nøyaktighet. Denne prosessen hjelper til med å skille mellom arvelige og somatiske endringer. Tumorprøvene analyseres videre for å identifisere somatiske mutasjoner, inkludert enkelt nukleotidvarianter (SNVs), ved bruk av verktøy som muTect2, Strelka2, og Lancet. Denne analysen kan kjøres både i union-modus, hvor alle identifiserte mutasjoner beholdes, eller i konsensus-modus, som kun beholder de som er påvist av minst to verktøy. Begge metodene har sine fordeler, avhengig av ønsket følsomhet og presisjon.

Videre, for å identifisere somatiske kopitallsendringer (CNAs), benyttes verktøy som FACETS, som også estimerer tumorens renhet og ploidi. Den samlede informasjonen om SNVs og CNAs blir deretter annotert og brukt til å rekonstruere tumorens klonale populasjonsstrukturer ved hjelp av verktøy som PhyloWGS, som gir et detaljert bilde av tumorens evolusjonære historie.

Blant de viktigste genomiske parameterne som benyttes for å karakterisere tumorens genetiske landskap, finner vi blant annet mutasjonsbelastning, som beskriver omfanget av genetiske endringer i tumoren, og microsatellittinstabilitet, en tilstand knyttet til defekte mekanismer for DNA-reparasjon. Det er viktig å merke seg at en høy mutasjonsbelastning kan påvirke tumorens respons på visse behandlinger. Den såkalte "genomic scar score" gir ytterligere innsikt i tumorens DNA-reparasjonskapasitet, og har vist seg å være en potensiell prognostisk indikator.

RNA-analyse er en annen viktig komponent i forståelsen av MM, da det gir innsikt i genuttrykk og eventuelle genfusjoner. Ved hjelp av verktøy som STAR og Arriba kan man identifisere både genfusjoner og ekspresjonsendringer som kan ha klinisk betydning. For å sikre at disse dataene er sammenlignbare på tvers av forskjellige prøver og teknologiske plattformer, benyttes metoder som DESeq2 for normalisering, og batch-effekter justeres for å eliminere tekniske variasjoner. Gjennom disse analysene blir dysregulerte gener identifisert, og det samme gjelder for RNA-metrikker som GEP70 og MM-PSN, som kan gi innsikt i sykdommens aggressivitet og subtyping.

Alle disse dataene, både fra DNA og RNA, blir sammenflettet i et omfattende og integrert rapportformat som gir pasienten og deres behandlende leger presis informasjon om tumorens genetiske egenskaper. Disse rapportene inneholder både teknisk informasjon og visuelle fremstillinger av resultatene, og er designet for å være lettfattelige for ikke-eksperter. I tillegg inneholder rapportene relevante litteraturhenvisninger for å støtte analysene og resultatene.

I tillegg til de tekniske analysene og rapportene er risikostratifikasjon i MM en avgjørende faktor for å kunne skreddersy behandlingen til den enkelte pasient. Det er utviklet flere modeller for risikovurdering, inkludert den reviderte internasjonale stadieinndelingen (R-ISS), som tar hensyn til både genetiske abnormiteter og laboratoriemålinger som LDH-nivåer. Ved å inkludere genetiske faktorer som t(4;14) og TP53-deletjon i risikovurderingen, får man et mer nyansert bilde av sykdommens potensielle utvikling. Modellen mSMART fra Mayo Clinic gir behandlingsanbefalinger basert på risikokategorier, og har vist seg å være nyttig for å tilpasse behandlingsstrategier, som stamcelletransplantasjon og vedlikeholdsbehandling.

Det er også verdt å merke seg at de ulike genetiske markørene som identifiseres, som tumorens mutasjonsbelastning og "scarHRD"-score, kan gi viktig informasjon om hvilken type behandling som vil være mest effektiv. For eksempel kan en høy mutasjonsbelastning indikere at pasienten vil ha større nytte av behandlinger som påvirker DNA-reparasjonssystemene.

I tillegg til de tradisjonelle risikovurderingssystemene er det også utviklet mer sofistikerte systemer som tar i bruk flere omics-data, som MM-PSN, som bygger på en nettverksbasert tilnærming for å gruppere pasienter basert på et bredt spekter av genetiske og molekylære endringer. Denne modellen gir ikke bare innsikt i pasientens spesifikke genetiske sammensetning, men gir også en robust prognostisk indikator for sykdommens fremtidige utvikling.

Endelig bør man også vurdere tumorens hallmarks, som er karakteristiske genetiske trekk ved MM, og gir ytterligere innsikt i sykdommens biologiske natur. Kjent for eksempel er kromosomtranslokasjoner som t(4;14), som kan indikere høy risiko for sykdomsprogresjon. Andre viktige markører som hyperdiploidi og TP53-deletjon kan gi ytterligere prognostiske signaler som kan påvirke beslutningene om behandling.

Hvordan celler-fri RNA kan hjelpe til med å identifisere krefttyper og mutasjoner

I denne studien ble et optimalisert arbeidsflyt etablert for ekstraksjon, kvantifisering og karakterisering av celler-fri RNA (cfRNA) fra blodprøver hos kreftpasienter. Denne metoden viste at isolert cfRNA hadde en god RNA-integritet og renhet, noe som er viktig for videre analyser. Videre ble det påvist at batch-effekten var lav, noe som er avgjørende for å sikre pålitelige resultater i store studier.

Ved hjelp av qPCR og sekvenseringsanalyser ble transcript-nivået for 18S rRNA og housekeeping-gener estimert, og disse resultatene samsvarte med forventningene. En viktig forskjell mellom qPCR og cfRNA-sekvensering er at den sistnevnte teknikken gir høy gjennomstrømning og kan oppdage de fleste transkripsjonene fra mer enn 19 000 kjente gener. Dette gjør det lettere å analysere store datamengder med lave kostnader per basepar, noe som gjør cfRNA-sekvensering til en kostnadseffektiv metode for molekylære analyser.

Genom- og pathway-analyser av cfRNA-sekvensering ga mulighet for å detektere isoformer av transkripsjoner og potensielle mutasjoner i disse, samt å identifisere spesifikke molekylære signaturer knyttet til ulike krefttyper. Ved å bruke disse signaturene kunne prøver stratigeres etter krefttype og de organene som var berørt. For eksempel ble det i analysene observert to distinkte grupper som var dominert henholdsvis av gastrointestinale svulster og lunge- og spiserørskreft.

Dette innebærer at cfRNA ikke bare har signaturer knyttet til mutasjoner, men også kan fange opp aktivitetsmønstre i kjerneveier som er karakteristiske for bestemte krefttyper. Sammenlignet med tradisjonelle vevsbiopsier gir cfRNA en mulighet for ikke-invasiv diagnostikk og oppdagelse av tumorer på et tidligere stadium, samt for å få mer detaljert informasjon om kreftens biologiske egenskaper.

I tillegg er det viktig å merke seg at cfRNA-sekvensering kan gi innsikt i mutasjoner som er relevante for målrettet behandling, og potensielt kunne bidra til utvikling av nye behandlingsmetoder. Dette er i tråd med funn i andre studier, hvor genomisk analyse av cfRNA har vist seg å være lovende i kreftdeteksjon og subtypeklassifisering. Ved å identifisere slike signaturer kan man ikke bare oppdage svulster, men også få informasjon om hvilke mutasjoner som kan være mål for spesifikke behandlinger.

Når det gjelder fremtidige trender, vil det kommende arbeidet være rettet mot å vurdere nytten av cfRNA som biomarkører for å klassifisere tumor subtyper, evaluere behandlingseffekter og potensielt forutsi behandlingsrespons. En viktig utfordring er imidlertid at cfRNA-sekvensering ikke gir informasjon om kromosomale kopinummerendringer eller ikke-kodende mutasjoner, som kan oppdages gjennom analyse av cfDNA. Dette betyr at kombinasjonen av cfDNA og cfRNA kan gi et mer komplett bilde av tumorens genetiske og ikke-genetiske egenskaper, noe som vil være avgjørende for fremtidig klinisk håndtering av kreftpasienter.

Den integrerte analysen av både cfRNA og cfDNA kan dermed potensielt tilby komplementær informasjon om svulster og deres mikromiljø, og hjelpe til med å forbedre presisjonen i kreftdiagnostikk og behandlingsvalg. Det er også viktig å forstå at mens cfDNA allerede benyttes i kliniske settinger for diagnostikk og monitoring av kreft, har cfRNA-sekvensering fortsatt et betydelig uforløst potensial som biomarkør for tidlig kreftdeteksjon, prognostisk vurdering og behandlingstilpasning.

Endtext

Hvordan IR-basert bildebehandling og maskinlæring forandrer patologiarbeidsflyt og diagnostikk

Den raske utviklingen av IR-bildebehandling og maskinlæring (ML) i patologi har begynt å definere en ny æra for medisinsk diagnostikk. Spesielt har innovasjoner som virtuell farging, bilde-segmentering og utvikling av deepfake-histologi modeller fått betydelig oppmerksomhet som muligheter for å transformere tradisjonelle patologiske arbeidsflyter. Denne teknologiske revolusjonen lover å gjøre diagnostiske prosesser både raskere, mer presise og mer innsiktsfulle, noe som til slutt kan forbedre pasientresultater gjennom bedre behandling og raskere diagnose.

De teknologiske fremskrittene som nå er tilgjengelige kombinerer avansert spektroskopi og maskinlæring for å skape en ny standard i patologi. Ved å analysere kjemiske og biologiske mønstre på molekylært nivå, kan vi få dypere innsikt i sykdomsprosesser og vevsmorfologi, noe som kan føre til mer presise diagnoser. IR-baserte teknologier, som har evnen til å identifisere spesifikke molekylære signaturer i vev, gjør det mulig å utføre undersøkelser som tidligere ville krevd tungt, tidkrevende arbeid.

I et av de undersøkte tilfellene ble et mikroskopisk vevsprøve fra brystvev brukt for virtuell farging, hvor data ble samlet inn gjennom midt-infrarød (IR) spektroskopi i 12 forskjellige bølgelengdeområder. Denne tilnærmingen gjør det mulig å skape nøyaktige "fargede" bilder basert på kjemiske signaturer, uten at det faktisk er nødvendig å bruke tradisjonelle fargestoffer. Virtuell farging kan dermed redusere bruken av dyre og tidkrevende kjemikalier, samtidig som det gjør det mulig å se vev under flere ulike "fargesystemer" med minimal belastning på prøven.

Et annet viktig aspekt er bilde-segmentering, en prosess der vevet deles opp i forskjellige histologiske komponenter. Dette er et steg som tidligere var manuelt og tidkrevende. Ved å bruke maskinlæringsalgoritmer, som for eksempel U-Net, kan IR-bilder automatisk segmenteres i ulike vevstyper, som epitel, mucin og stromale celler. Ved å bruke nøyaktige data og avanserte bildebehandlingsteknikker kan vi dermed oppnå segmentering med høy presisjon, som tidligere krevde både ekspertvurdering og mye tid.

Deepfake-histologi, en annen tilnærming i den moderne patologi, er utviklingen av syntetiske histologiske bilder ved hjelp av generative motstridende nettverk (GANs). Ved å bruke et stort datasett med vevsbilder og deres tilhørende histologiske vurderinger kan det genereres syntetiske bilder som etterligner det virkelige vevet. Dette gjør det mulig å utvikle modeller som kan hjelpe patologer med å trene og analysere vev uten å bruke ekte prøver, noe som reduserer både kostnader og risikoen for biologisk materiale som kan forurenses eller gå tapt.

Metodene som benyttes for disse fremskrittene i bildebehandling er sofistikerte, og de innebærer bruken av dype nevrale nettverk og optimaliseringsteknikker som Adam-optimatoren. Disse verktøyene gjør det mulig å justere modeller gjennom mange iterasjoner for å oppnå høyest mulig presisjon i oppgaver som bildeklassifisering og -segmentering. Selv om det er behov for datakraft på høyeste nivå, som bruk av NVIDIA V100 GPU-er, har disse modellene allerede vist seg å være svært effektive i å håndtere store mengder biologisk data.

Den største fordelen med denne teknologien er ikke bare at den gjør patologiarbeidet mer effektivt, men at den kan bidra til å redusere menneskelige feil i diagnostikk. Tradisjonelle patologiske arbeidsflyter er ofte preget av stor manuell arbeidsmengde, som kan føre til variasjon i resultatene avhengig av teknikerens erfaring og nøyaktighet. IR-bildebehandling og ML-redskapene reduserer den menneskelige faktoren i stor grad ved å gi et mer standardisert og presist grunnlag for diagnostiske vurderinger.

Det er imidlertid viktig å merke seg at disse teknologiene, selv om de tilbyr store fordeler, ikke fullstendig kan erstatte den ekspertvurderingen som patologer bidrar med. Maskinlæring og IR-bildebehandling gir verktøy for å understøtte den menneskelige vurderingen, men det er fortsatt avgjørende at kvalifiserte eksperter utfører de endelige vurderingene. Teknologiens potensial ligger derfor i å styrke de medisinske ekspertene, ikke nødvendigvis erstatte dem.

Disse fremskrittene har imidlertid ikke bare en teknologisk betydning, men også en betydelig innvirkning på pasientbehandlingen. Takket være forbedringer i diagnostikkens hastighet og nøyaktighet, kan pasienter få raskere tilgang til behandlingsplaner som er mer tilpasset deres spesifikke sykdomstilstand. Dette kan i sin tur føre til bedre resultater for pasientene, redusert behandlingskostnad og en mer effektiv helsesektor generelt.

En annen viktig faktor å merke seg er hvordan disse teknologiene kan bidra til en mer global tilnærming til medisinsk forskning og behandling. Ved å gjøre teknologiene mer tilgjengelige, kan forskere og klinikere fra hele verden dele data og resultater på tvers av grenser, noe som kan akselerere utviklingen av nye behandlingsmetoder og diagnostiske verktøy. Dette globale samarbeidet kan gjøre det mulig å takle helseutfordringer på en mer samlet og effektiv måte.