Hvordan BCARS Mikroskopi kan revolusjonere Kreftdiagnostikk og Forskning

BCARS-mikroskopi (Broadband Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) representerer en spennende utvikling innen medisinsk bildebehandling, og tilbyr en revolusjonerende måte å analysere vev på uten behov for farging. Denne teknologien kan gi rask, subcellulær oppløsning og detaljert kjemisk informasjon som kan være avgjørende for diagnostikk og forskning på kreft. Den gir spesifikke signaler som kan indikere viktige kjemiske endringer assosiert med kreft, som forskjeller i proteiner, lipider og nukleinsyrer, som kan relateres til tumorens metabolisme og funksjonelle tilstand.

En av de store fordelene ved BCARS-mikroskopi er dens evne til å skaffe Raman-spektra med høy hastighet, noe som tidligere ikke har vært mulig. Tradisjonelle metoder for Raman-spektroskopi har vært for langsomme til å brukes effektivt på vevsskanninger, men BCARS-teknologien kan registrere spektra ved 300 nm oppløsning, noe som gir informasjon tilsvarende en dyp transcriptomisk lesning. For kreftforskning kan dette bety en mer presis kartlegging av metastatiske endringer på cellulært nivå.

I tillegg er BCARS i stand til å gi informasjon om tumorheterogenitet, spesielt når det gjelder metabolisme og immunfunksjoner, som er viktige for å forstå tumorens mikromiljø og hvordan kreftceller reagerer på behandling. Raman-spektra kan brukes til å lage bilder som etterligner tradisjonell H&E-farging, men samtidig inneholder de informasjon som strekker seg langt utover det enkle utseendet av vevet. Dette kan være til stor hjelp for patologer som bruker Raman-signaturer for å identifisere og karakterisere forskjellige typer kreftvev.

Til tross for disse fordelene er BCARS-mikroskopi fortsatt en kompleks og kostbar teknologi. Nåværende BCARS-mikroskoper krever omfattende ekspertise både i instrumentvedlikehold og bildebehandling, noe som begrenser bruken til spesialiserte forskningsmiljøer. Teknologien krever fortsatt videreutvikling for å bli kommersielt tilgjengelig og enklere å bruke i kliniske og biologiske laboratorier. Dette innebærer både forenkling av maskinvare og forbedring av signalbehandlingen. Et mål er å gjøre teknologien mer tilgjengelig for et bredere medisinsk publikum, noe som krever betydelige fremskritt innen instrumentdesign og signalprosessering.

En viktig utfordring er signalbehandlingen som kreves for å tolke BCARS-dataene. For øyeblikket er de fleste signalbehandlingspipelinene for BCARS svært tidkrevende og krever omfattende brukertrening. Dette gjør det vanskelig å bruke BCARS rutinemessig i kliniske sammenhenger. Maskinlæringsmetoder er under utvikling for å forbedre disse prosessene, og viser lovende resultater, noe som kan føre til mer automatisert og effektiv databehandling i fremtiden.

Den største potensialen for BCARS ligger imidlertid i muligheten til å integrere Raman-spektra med andre biologiske data, som -omics. Dette kan bidra til å bygge en mer omfattende forståelse av hvordan biologiske systemer fungerer på molekylært nivå, og hvordan spesifikke spektrale signaturer er relatert til biologiske funksjoner. Dette kan åpne døren for mer presis diagnostikk og bedre tilpassede behandlingsstrategier for kreftpasienter. Ved å bruke BCARS til å generere store mengder data, kan vi forvente en raskere vekst i vår evne til å knytte disse spektrale signaturene til spesifikke sykdomsprosesser.

For å nå sitt fulle potensial må BCARS også begynne å bli bredt brukt på tvers av forskningsmiljøer, og dataene må kunne standardiseres og deles, på samme måte som for eksempel massepektrometri. Dette vil akselerere utviklingen av pålitelige, robuste metoder for å analysere BCARS-data og sikre at resultatene er sammenlignbare på tvers av laboratorier og instrumenter. Når dette er oppnådd, vil BCARS kunne spille en nøkkelrolle i både klinisk diagnostikk og grunnforskning på kreft.

Hvordan MxIF-teknologi Forbedrer Forståelsen Av Tumor-Immunsystemet I Melanomaforskning

Tumor-immune microenvironment (TIME) refererer til de komplekse interaksjonene mellom kreftceller og immunceller i tumorens lokale miljø. Disse interaksjonene spiller en avgjørende rolle for tumorens utvikling, vekst og metastasering, samt påvirker hvordan tumoren reagerer på immunterapi. Den tradisjonelle metoden for å studere disse interaksjonene var mikroskopi, som i stor grad fokuserte på cellulære strukturer og visuelle kjennetegn som kunne kobles til tumorens romlige organisering. Imidlertid ble denne teknikken ofte begrenset av evnen til å analysere kun én biomarkør per vevsprøve, noe som gjorde det vanskelig å få et helhetlig bilde av TIME.

I de siste tiårene har metoden for multiplexet immunfluorescens (MxIF) blitt en uunnværlig teknologi i melanomforskning. Denne teknikken muliggjør samtidig visualisering og kvantifisering av flere biomarkører (proteiner eller cellemarkører) i én enkelt vevsseksjon. Dette gjør det mulig å få en omfattende karakterisering av TIME, ved å vurdere flere immuncelletyper, deres aktiveringsstatus, distribusjonsmønstre og interaksjoner med tumorcellene.

MxIF-teknologiens prosess består av flere trinn: Først samles vevsprøvene inn, fikseres og inkorporeres i paraffin eller fryseseksjoner. Antigenene i prøvene eksponeres ved hjelp av metoder som varmeindusert epitopehenting eller enzymatisk fordøyelse. Deretter benyttes flere antistoffkloner som konjugeres med forskjellige fluoroforer, som gjør det mulig å visualisere hvert biomarkørsignal. Bildene som genereres under denne prosessen, er resultatet av en sekvens av farging, skanning og bleking (dvs. inaktivering av fluorescerende signaler).

Den store mengden høyoppløselige bilder som genereres gjennom MxIF, medfører også utfordringer når det gjelder datalagring, behandling og analyse. Automatiserte metoder for celle-segmentering og bildeanalyse, som DeepCell og Stardist, benyttes for å identifisere cellegrensene og kvantifisere cellene basert på proteinmarkerens nivåer. I den påfølgende analysen kan cellene kategoriseres i subtyper, og deres interaksjoner kan studeres for å avdekke mønstre som kan ha biologisk betydning, for eksempel i forhold til pasientens behandlingsrespons eller tilbakefall.

Gjennom arbeidet vårt med MxIF i melanomforskning har vi undersøkt lymfeknuteprøver fra pasienter med regionalt metastatisk melanom som hadde gjennomgått anti-PD1 terapi. Ved hjelp av 45 proteinmarkører i MxIF-bildene oppnådde vi nøyaktige resultater for celle-segmentering og klassifisering. Dette gjorde det mulig å utføre kvantitative vurderinger av de romlige interaksjonene mellom immunsystemet og melanomceller. En viktig observasjon fra analysen var at berikelse av dendrittiske celler i tumorens nærmiljø var assosiert med en bedre behandlingsrespons, og dette kan ha betydning for utviklingen av mer presis immunterapi.

Det er derfor klart at MxIF gir en kraftig metode for å analysere den heterogene strukturen til TIME i melanom og potensielt andre kreftformer. Selv om teknologien har sine utfordringer, gir den innsikt som er viktig for å forstå hvordan tumorcellene samhandler med immunsystemet, og hvordan disse interaksjonene kan utnyttes til å utvikle mer effektive behandlingsstrategier.

Når man benytter MxIF, er det viktig å forstå at det er en kontinuerlig prosess med optimalisering. Dette inkluderer nøye valg av antistoffer, fargingsteknikker, bildebehandling og databehandling for å sikre pålitelige resultater. Videre bør man være oppmerksom på at datainnsamlingen og -prosessen kan være ressurskrevende og kreve betydelig kompetanse både i laboratoriet og i analysearbeidet. Likevel representerer teknologien en stor fremgang i å forstå kreftens mikromiljø på en detaljert og nøyaktig måte.

Hvordan SOCT og ISOCT kan revolusjonere diagnostikk av tarmkreft

En annen tilnærming, kjent som invers spektroskopisk OCT (ISOCT), benytter en streng modell for vevets spredningsegenskaper for å bestemme de optiske egenskapene fra SOCT-data. Denne metoden har blitt brukt til å skille avanserte adenomer i kolonepitel fra biopsiprøver, og nyere forskning har vist at ISOCT kan forbedre diagnostikkens presisjon ved hjelp av dyp læring.

Videre har SOCT blitt brukt i musmodeller for kolonepolypper for å evaluere vevstype med høy nøyaktighet, og til å skille mellom ulike polypper med tanke på deres malignitetspotensial. Denne tilnærmingen har vist stor lovende presisjon, spesielt når den kombineres med analyser av vevets optiske egenskaper som spredningskoeffisient og spredningskraft.

I en klinisk studie for menneskelige kolonepolypper ble SOCT også benyttet til å analysere optiske egenskaper fra forskjellige adenometyper i menneskelige kolonepitel. Ved å bruke en dyp læringsklassifiserer, som ble konstruert med de optiske koeffisientene fra SOCT-dataene, ble det mulig å oppnå en nøyaktighet på 93,2 % i identifiseringen av ulike vevstyper, inkludert benigne, tubulovilløse og tubulære polypper. Denne metoden muliggjorde en betydelig reduksjon i datakravene sammenlignet med tradisjonelle dybdemålinger, og den ga raske og pålitelige resultater.

Kombinasjonen av spredningsattenuasjonskoeffisienter og spredningskraft gjennom dyp læring har vist seg å være en effektiv metode for å klassifisere polypper og identifisere maligne lesjoner. Klassifiseringen ble utført på mer enn 100 000 optiske biopsier med en gjennomsnittlig prosesseringstid på bare 0,2 millisekunder per analyse. Resultatene viste en total nøyaktighet på 97,9 %, med høy sensitivitet og spesifisitet, og en positiv prediktiv verdi på 98,6 %. Dette indikerer et stort klinisk potensial for tidlig påvisning og behandling av tarmkreft.

I tillegg til den imponerende nøyaktigheten som ble oppnådd i disse studiene, er det viktig å merke seg at dagens koloskopi-prosedyrer ofte tar biopsier fra hovedsakelig benigne områder, og derfor kan eventuelle feildiagnoser som følge av feilklassifisering ikke medføre alvorlige konsekvenser. Feilklassifisering vil mest sannsynlig resultere i et ekstra biopsiutdrag fra et potensielt godartet område, noe som er et relativt lavt risiko i klinisk sammenheng.

Det er også viktig å påpeke at bruken av SOCT i tidlig diagnostisering kan bidra til å redusere behovet for mer invasive prosedyrer, samtidig som det gir raskere, mer pålitelige resultater. Denne teknologien kan dermed bli et avgjørende verktøy for fremtidens kreftdiagnostikk, spesielt i screening for tarmkreft og i vurdering av kolorektale polypper. Fremtidige forbedringer og integrering av ISOCT og dyp læring kan åpne nye muligheter for mer presis og tidlig identifisering av tarmkreft.

Hvordan dielektroforese kan samle biomarkører fra plasma med mikroelektrode-array

Mikrofluidiske enheter, som er hjertet i DEP-teknologien, kan bestå av små kanaler og mikroelektroder som fungerer som aktive elementer for å generere elektriske felter. I vår prosedyre for nanopartikkelsamling fra plasma, ble en mikrofluidisk chip utstyrt med en array av mer enn 700 platina mikroelektroder, hver med en diameter på 60 mikrometer. Dette muliggjør en presis styring av elektriske felter på små områder, som igjen gjør det mulig å trekke de ønskede nanopartiklene mot elektrode-kantene, der det elektriske feltet er sterkest.

Før prøvene blir tilført, pre-behandles chipen ved hjelp av et vekselstrømsignal på 6–10 Vpp og en frekvens på 14 kHz. Dette bidrar til at et hydrogelbelegg på elektrodens overflate danner en lukket kuppelstruktur, som forbedrer evnen til å samle opp partikler. Når plasmaet deretter tilføres til mikrofluidikk-kammeret, påføres et AC-signal for å generere DEP-krefter, som trekker de biologiske nanopartiklene mot elektrode-kantene. Denne prosessen varer i omtrent ti minutter.

Etter at nanopartiklene er samlet rundt elektroden, blir uønsket plasma vasket bort ved hjelp av en PBS-løsning (0,5X), som rensker systemet og etterlater de ønskede partiklene. For å visualisere de samlede nanopartiklene benyttes teknikker som fluorescensmikroskopi, hvor fargete partikler som polystyrenbeads kan sees og identifiseres under mikroskopet. Disse bildene er avgjørende for å analysere hvilke biomarkører som er til stede i prøven. Scanning elektronmikroskopi (SEM) benyttes også for å få detaljerte bilder av de frosne og tørkede partiklene for videre analyse.

En viktig del av prosessen er immunfarging for kvantifisering av biomarkører. Først tilsettes en blokkeringbuffer bestående av 2 % fettfri melk i PBS, som reduserer uspesifikk binding av antistoffer. Primærantistoffer, som er spesifikke for de ønskede biomarkørene, blandes deretter med prøven og inkuberes. Etter vask blir fluorescerende sekundærantistoffer tilført, og til slutt tas bilder som viser intensiteten av fluorescenssignalene, som reflekterer tilstedeværelsen av biomarkørene. Spesialutviklede analyseprogrammer kan deretter kvantifisere disse signalene ved å eliminere bakgrunnsstøy og identifisere eventuelle artefakter som kan forvride resultatene.

Enkelte biomarkører, som CD63 for eksonomer fra brystkreftpasienter, kan lett samles med denne teknikken. Teknologien kan også anvendes for å samle celler, mikrovesikler, DNA, og til og med hele bakterier som har blitt genetisk modifisert til å produsere fluorescerende signaler ved interaksjon med spesifikke biomarkører, som laktat. Dette åpner døren for potensielt rask og kostnadseffektiv diagnostikk av sykdommer, inkludert kreft og bakterielle infeksjoner.

Det er også viktig å merke seg at DEP-teknologiens nøyaktighet og effektivitet er sterkt avhengig av flere faktorer, som kvaliteten på elektrodematerialet, frekvensen og intensiteten til det elektriske signalet, og sammensetningen av væsken som prøven befinner seg i. Det er nødvendig å optimalisere disse parameterne for å maksimere utbyttet av biomarkører, samt for å sikre at de biologiske partiklene ikke blir skadet i prosessen.

Kan øyebevegelser avsløre savnede lungeknuter i CT-bilder?

I diagnostisk medisin er det velkjent at radiologer kan overse små detaljer i bildene de analyserer. Et område som har fått økende oppmerksomhet, er hvordan non-bevisste prosesser, som er registrert gjennom øyebevegelser og pupillestørrelse, kan påvirke beslutningene våre uten at vi er klar over det. I vår studie har vi utforsket om disse non-bevisste prosessene kan benyttes i maskinlæring for å forbedre deteksjonen av savnede lungeknuter i CT-bilder. Det som er spesielt i denne tilnærmingen er at vi isolerer de fysiologiske reaksjonene som er registrert gjennom pupillens diameter og øyebevegelser, og bruker disse som indikatorer for å predikere steder der radiologene ikke har bevisst identifisert en knute.

En viktig del av vår tilnærming var hvordan vi håndterte databehandling og normalisering. For at alle de fysiologiske parametrene som pupillestørrelse, fixasjonsindeks og fixasjonsvarighet skulle bidra likt i treningen av modellen, ble de alle normalisert til et felles intervall mellom 0 og 1. Dette sikrer at ingen enkeltparameter dominerer treningen, uavhengig av deres opprinnelige skala.

Videre ble hyperparametrene i maskinlæringsmodellen optimalisert ved hjelp av en metode kjent som "single parameter range search", der vi gradvis tester forskjellige verdier for hvert parameter og velger den beste verdien basert på testresultater. De optimaliserte hyperparametrene inkluderte blant annet antall blader i beslutningstreet (300), læringsrate (0,1), og minimum antall barn for å dele et internnode (44). Gjennom gjentatte iterasjoner ble modellen finjustert for å unngå overfitting og sikre god generalisering til testdata.

Et viktig resultat fra vår studie var at radiologene i gjennomsnitt overså 59% av de vanskelige å oppdage lungeknutene. Samtidig ble det registrert mer enn dobbelt så mange falske positive resultater. Interessant nok viste det seg at radiologene, når de så på noduler som de ikke bevisst hadde oppdaget, hadde betydelig lengre blikkvarighet sammenlignet med normal lungevev. Denne lengre blikkvarigheten er et tydelig tegn på at radiologen ubevisst hadde registrert nodulets tilstedeværelse, men ikke bevisst anerkjent det.

I tillegg til blikkvarighet ble det også målt fysiologisk arousal, representert ved pupillens diameter, ved de samme stedene. Her fant vi også en signifikant økning i pupillens størrelse når radiologene så på områder med savnede knuter. Denne fysiologiske responsen kan gi verdifulle ledetråder om at selv når en radiolog ikke bevisst anerkjenner en knute, kan kroppen reagere på informasjon som ikke er tilgjengelig for den bevisste oppfatningen.

Modellen vår viste seg å være svært effektiv i å oppdage savnede noduler. De ikke-bevisste prosessene som ble indikert av endringer i øyebevegelser og pupillestørrelse, var i stand til å påvise knutene med en gjennomsnittlig nøyaktighet på 66%, noe som er et imponerende resultat for en modell som ikke benyttet noen form for bevisst registrering eller ekstra informasjon fra CT-bildene. Dette kan ha stor betydning for fremtidige verktøy som kan hjelpe radiologer med å finne savnede noduler som ellers ville blitt oversett.