Hvordan analysere kryssbundet peptidinteraksjoner i proteomikk

I proteomikk er forståelsen av protein-protein-interaksjoner avgjørende for å avdekke biologiske mekanismer på molekylært nivå. En metode som har fått økt popularitet for å studere slike interaksjoner er kryssbinding av peptider, hvor kjemiske krysslinkere som DSS (Disuccinimidyl suberate) brukes til å binde sammen proteiner i nære fysikalske nærheter. Når en proteinbinding er kryssbundet, blir det enklere å kartlegge og visualisere interaksjoner som ellers kan være vanskelig å studere.

I prosessen med kryssbinding blir lysinrester i proteiner koblet sammen gjennom en terminal NH3-gruppe, og denne reaksjonen kan effektivt fryses ved å unngå buffere som inneholder frie aminer, som Tris- eller ammoniumbaserte buffere, da disse vil deaktivere reaksjonen. For pålitelige kryssbindinger anbefales det å bruke standard DSS, som er tilgjengelig fra ulike leverandører som Sigma, og det viser seg å være like effektivt som mer kostbare alternativer. Det er viktig å merke seg at når løsningen av IAA (iodoacetamid) tilberedes, bør den lages fersk samme dag og oppbevares i mørket for å forhindre nedbrytning.

Et annet teknisk aspekt er at kryssbundne peptider ofte har ladningstilstander høyere enn 2, noe som gjør at de kan oppdages lettere i massespektrometriske analyser. Under prøvehåndtering bør man unngå plastutstyr som tips og målebegre, særlig når man jobber med konsentrerte syrer som maursyre, for å unngå forurensning av prøvene.

For å analysere dataene som genereres ved kryssbinding, benyttes spesifikke verktøy og plattformer som MaxQuant, pLink2 og Perseus, som kan konvertere og analysere data i formater som mzML og mgf. Disse verktøyene er ofte brukt i proteomikk for å håndtere kompleks data fra massespektrometri og for å gi innsikt i de protein-interaksjonene som er involvert i biologiske prosesser. Det er viktig å merke seg at alle dataene som brukes til å analysere disse interaksjonene, ofte blir delt med større databaser som ProteomeXchange og MassIVE, for å sikre reproduserbarhet og tilgjengelighet for andre forskere.

For at analysene skal gi pålitelige resultater, må man være klar over at visse proteiner kan inneholde store uordnede regioner som ikke kan modelleres eller dockes pålitelig. Disse regionene bør derfor ofte utelates fra modelleringen, for å unngå feilaktige eller misvisende resultater. En annen utfordring er at interaksjoner mellom forskjellige proteiner kan variere avhengig av miljøfaktorer, som pH eller tilstedeværelsen av spesifikke ligander, noe som kan påvirke kryssbindingsprosessen.

Derfor er det viktig å bruke flere verktøy og teknikker for å validere de oppnådde resultatene. Dette inkluderer både eksperimentelle metoder som nærhetsmerking og krysslinking, samt datamodeller som kan håndtere stor og kompleks proteomdata for å identifisere relevante biologiske interaksjoner. Kombinasjonen av disse metodene gir et sterkt grunnlag for videre forskning på proteinfunksjon og sykdomsmekanismer, spesielt i sammenheng med vert–patogen-interaksjoner, hvor protein-kryssbinding kan bidra til å avdekke hvordan patogener manipulerer vertens celler for å etablere infeksjoner.

Videre, for å forstå den fullstendige biologiske konteksten av de oppdagede interaksjonene, er det viktig å integrere proteomdata med andre typer omics-data, som genomiske eller transcriptomiske data. Dette gir en helhetlig tilnærming til å studere proteinfunksjon og sykdomsprosesser på tvers av flere nivåer i biologien.

Hvordan Bestemme Affinitet for Antistoffbinding på Bakterieoverflater

En vanlig brukt målestokk for affinitet er dissosiasjonskonstanten KD, som kan uttrykkes som forholdet mellom konsentrasjonen av bundne komplekser og den frie konsentrasjonen av antistoff og epitope. KD kan beregnes etter følgende formel:

Når man arbeider med bakterier, kan det være utfordrende å bruke standard metoder for affinitetsmåling, som overflateplasmonresonans (SPR) eller isoterme titrasjonskalorimetriske teknikker, ettersom disse krever rensede proteiner og ikke er effektive for måling på bakterieoverflater. Dessuten kan mange overflateproteiner være vanskelige å opprettholde i en fysiologisk konformasjon utenfor deres naturlige miljø. Historisk sett har radioligandassays blitt brukt for å vurdere affiniteten til proteininteraksjoner med intakte bakterier, men i dag gir moderne flowcytometere høy presisjon, og direkte datatilpasning gir mer nøyaktige resultater.

Når man utfører eksperimenter for å måle affinitet, er det flere viktige eksperimentelle faktorer som må vurderes. Først må man sikre at bindingen har hatt nok tid til å nå likevekt, noe som kan kontrolleres ved å gjøre inkubasjonstid-kontroller for å bestemme hvor lenge bindingen trenger for å stabilisere seg. Det er også viktig å ha antigenepitoper til stede i en konsentrasjon som er langt lavere enn KD. Dette er ofte vanskelig å forutsi på forhånd, og det er ikke alltid lett å vurdere antallet epitoper tilgjengelig på bakterieoverflaten.

Videre er det viktig å merke seg at KD er avhengig av de frie konsentrasjonene av både antistoff og epitope, og derfor må disse verdiene være stabile gjennom hver måling. Dette er spesielt kritisk ved lavere affiniteter, der det ellers kan oppstå en risiko for å undervurdere affiniteten. For å unngå slike feil, er det viktig å bruke metoder som opprettholder stabile mengder antistoffer, for eksempel ved å unngå vasking av primære antistoffer i assayer som måler lav-affinitet (μM området). Dette kan oppnås ved at man ikke vasker antistoffene før målingene.

Det er også viktig å vurdere om bakteriene har IgG-bindende proteiner på overflaten, som kan forstyrre bindingen. I slike tilfeller kan det være nyttig å utføre enzymatisk spalting av antistoffene på hinge-regionen ved hjelp av IdeS.

Når man forbereder bakteriene, starter man vanligvis med en kultur som inkuberes over natten, og deretter blir bakteriene centrifugert, vasket og sonikert. Antistoffene bør deretter inkuberes med IdeS før de blandes med bakterieprøvene. Det er viktig å tilberede en rekke fortynninger av antistoffene og bruke en lav-bindings 96-brønnsplate for å redusere tap av antistoffer til plateoverflaten. Når bakteriene er merket med et fluorescerende sekundært antistoff, blir de kjørt gjennom en flowcytometer for å samle data om bindingen.

Ved å bruke en slik protokoll kan man oppnå nøyaktige målinger av antistoffenes affinitet til bakterieoverflater. Disse målingene kan gi verdifull innsikt i antistoffenes potensial for å binde og nøytralisere bakterier, noe som er viktig for både grunnleggende forskning og kliniske applikasjoner.

Hvordan infisere BMDM-celler og vurdere inflammasomaktivering ved hjelp av GAS

Metodene for infeksjon og inflammasomaktivering hos murine beinmargderiverte makrofager (BMDM) krever presisjon og nøyaktighet, spesielt når det gjelder overføring av bakterier og påfølgende analyse av inflammasomaktivering. Protokollene nedenfor beskriver trinnene for effektiv infeksjon og påfølgende evaluering av inflammasomaktivering via sekresjon av proinflammatoriske cytokiner som IL-1β og IL-18.

For å begynne prosessen, overfør bakteriene til et kulturrør ved hjelp av et sterilt inokulasjonshjul eller en vattpinne, og plasser røret i inkubatoren over natten ved 37°C med 5% CO2. Det er viktig å la lokket på kulturrøret være litt åpent for å forhindre oppbygging av trykk, men uten behov for omrøring. Samtidig plasseres et annet rør som kun inneholder THY-medier i inkubatoren for å sikre at mediet ikke er kontaminert.

Når BMDM-ene er primet med LPS (lipopolysakkarid) for å fremme inflammasomaktivering, inkuberes de ved 37°C i 5% CO2 i en periode på 4-15 timer, avhengig av eksperimentets krav. LPS inducerer en inflammatorisk respons i cellene, som er et viktig forspill før bakteriell infeksjon.

Infeksjon med GAS (Group A Streptococcus) skjer ved at en nattkultur av bakterier tilsettes til THY-broth, som deretter inkuberes til bakteriell vekst når OD600-nivået er på sitt høyeste, hvilket indikerer sen eksponentiell vekstfase. Bakteriene sentrifugeres og resuspenders i PBS før de fortynnes til ønsket MOI (multiplicité of infection). Etter at BMM-celler er primet, tilsettes bakterieløsningen til kulturbrønnene, og platen sentrifugeres for å sikre at bakteriene fester seg til cellene.

Etter infeksjonen inkuberes kulturene videre, og gentamicin tilsettes for å drepe eventuelle ekstracellulære bakterier som ikke har invadert makrofagene. På dette tidspunktet er det viktig å evaluere inflammasomaktivering. En metode for dette er å analysere sekresjon av cytokiner som IL-1β og IL-18, ved hjelp av ELISA. Det er også mulig å bruke western blot for å påvise modne, aktivert caspase-1 og cytokiner, som gir en mer presis vurdering av inflammasomaktiveringen, ettersom ELISA-kits ofte ikke kan skille mellom pro- og cleaved former av disse proteinene.

For å optimalisere resultatene og sikre nøyaktighet, er det viktig å vurdere et par faktorer i tillegg til de standard prosedyrer som er beskrevet:

• Husk at inflammasomaktivering kan variere avhengig av hvilken type cellekultur og hvilke stimuli som benyttes. For BMDM-er er LPS og bakterielle infeksjoner de vanligste induktorene, men andre faktorer som ATP eller Nigericin kan også benyttes for å fremme aktivering.

• For å sikre nøyaktighet i dine resultater, er det avgjørende å bruke riktig fortynning av bakteriekulturen og beregne MOI nøye. Dette kan gjøres ved hjelp av serielle fortynninger og deretter plating på blodagar for å telle koloniene.

• Før du gjennomfører disse eksperimentene, bør du også sørge for at alle reagenser og materialer er riktig forberedt og at kulturforholdene er optimale for BMDM-ene, ettersom deres respons på bakteriell infeksjon kan påvirkes av flere faktorer, inkludert inkubasjonstemperatur og CO2-nivåer.

Når det gjelder western blot og ELISA, er det viktig å være oppmerksom på at immunblotting kan være mer sensitiv når det gjelder å identifisere små mengder cleaved cytokiner i supernatanten, noe som kan være avgjørende for å bekrefte inflammasomaktiveringen nøyaktig. Størrelsen på cleaved proteiner kan variere, så vær forberedt på å gjøre justeringer av antistofffortynningene og kontrollere at probene fungerer optimalt for ditt spesifikke eksperiment.

Endelig er det alltid nyttig å ha en positiv kontroll, for eksempel LPS eller en kjent inflammasomaktivator, for å bekrefte at eksperimentet fungerer som forventet før du gjennomfører komplekse eksperimenter.