Hvordan kultivere og analysere pneumokokker i laboratoriet: Nøkkelfaktorer for vellykket biofilmvekst og antibiotikafølsomhet

Pneumokokker er svært følsomme for optochin og viser en hemning av vekst rundt en optochin-sirkel (Sigma) plassert på et blodagar-plater etter en natts inkubasjon. Det er viktig å merke seg at pneumokokkers levedyktighet på agarplater synker med lengre inkubasjonstid. Derfor er det anbefalt å plater bakteriene sent på dagen og inokulere tidlig på morgenen, med en optimal inkubasjonstid på 12–14 timer.

Forberedelse av fryseprøver anbefales sammenlignet med flytende kulturer som er sådd fra pneumokokker dyrket på blodagarplater. Den sistnevnte metoden krever lengre og mer variabel inkubasjonstid, og resultatene er ikke like reproduserbare som når man bruker fryseprøver fra samme lager. Fryseprøver kan lages i ulike volum, avhengig av hva de skal brukes til. DMSO, som er giftig for cellene, bør fjernes så mye som mulig, men noen celler reagerer dårlig på sentrifugering rett etter tining. I slike tilfeller fungerer vanligvis fortynning i tilstrekkelig med medium bra.

Temperaturen på 34 °C er valgt for å etterligne den målte temperaturen i nasofarynx-miljøet. Tidligere forskning har vist at biofilm-dannelse forbedres ved 34 °C for pneumokokker, i motsetning til ved 37 °C, og dette gjelder også for andre arter som bor i nasofarynx. Valg av medium spiller en viktig rolle for biofilm-dannelse. Pneumokokker danner ikke godt strukturerte og funksjonelle biofilmer i næringsrike medier som THY eller hjernebrot-infusjon. For å fremme optimal vekst av biofilmer, anbefales det å inokulere bakteriene så tidlig på dagen som mulig, slik at et første mediumbytte kan utføres senere på samme dag. Regelmessig mediumbytte (minst hver 12. time) er avgjørende for å hindre pneumokokkene i å gjennomgå autolyse og sikre at biofilmen forblir stabil i opptil en uke. Selv om biofilm-dannelse kan påvises etter 24 timer, krever pneumokokker vanligvis 48–72 timer for å danne robuste biofilmer. Imidlertid kan veksttid og frekvens for mediumbytte variere avhengig av den pneumokokke stammen som brukes, og hvilke karbonkilder som er tilgjengelige.

Den første 24-timers perioden er kritisk, da biofilmene er skjøre og må håndteres forsiktig når mediet fjernes og byttes. Det er viktig å ikke bruke en vakuum-aspirator, da denne kan påføre for mye skjærkraft. En serologisk pipette på 5 mL eller 10 mL er bedre enn en 1 mL pipette for både fjerning og tilsetting av nytt medium. Noen stammer og arter danner robuste biofilmer etter 48 timer, mens andre, og de som vokser i visse karbonkilder, kan kreve lengre tid (72–96 timer).

Når man prøver å bryte opp biofilmene, er det viktig å bruke en pipette med en spiss ende (20–200 μL) for å skrape bunnen av 24-brønnsplaten, ved å bruke et top-down og left-to-right mønster. Suspensjonen bør pipetteres opp og ned for å ytterligere forstyrre biofilm-bakteriene, men uten å introdusere bobler. Sonikering kan løsne biofilmaggregater, men det bør ikke vare mer enn 2 sekunder, da dette kan føre til bakterie-lyse. For nøyaktige telleresultater bør biofilm-bakteriene brytes ned til enkeltceller før de plateres.

Under mikroskopering av biofilmprøver kan det oppstå lading som et resultat av ufullstendig dehydrering under prøvehåndteringen. For å redusere ladingen kan prøvene sputtercoates med for eksempel krom eller palladium/gull.

Når man lyser bakterier for assays, har Triton-X100 vist seg å være effektivt, mens andre anioniske og kationiske tensider, som SDS og deoksikolinsyre, kan hemme bruken av luciferase i assaysystemet.

I arbeidet med å isolere og analysere biofilmer bør en grundig forståelse av de biologiske prosessene bak biofilm-dannelse være påkrevd. Biofilmer er ikke bare en beskyttende struktur mot ytre påkjenninger som antibiotika, men også et resultat av bakterienes tilpasning til vertens miljø.

Hvordan analyse av vertens inflammatoriske responser kan kaste lys over interaksjoner mellom anaerobe bakterier og immunceller

Gram-positive anaerobe kokker (GPAC) har lenge vært oversett som patogener, mye på grunn av de tekniske utfordringene knyttet til dyrking og identifisering. Disse bakteriene er imidlertid stadig mer gjenstand for forskning, som avslører deres viktige rolle i infeksjoner som tidligere ble undervurdert. En av de mest studerte arter i denne gruppen er Peptoniphilus harei (P. harei), som har vist seg å være involvert i infeksjoner som blodforgiftning, sårinfeksjoner og til og med neonatal sepsis.

Den avanserte teknologien som nå er tilgjengelig for identifikasjon av anaerobe bakterier, som MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry) og 16S rRNA-sekvensering, har markert et gjennombrudd i nøyaktigheten av artsspesifikk identifikasjon. Denne forbedringen i tekniske metoder har gjort det mulig å identifisere P. harei mer effektivt, og forskning antyder at denne bakterien kan være en prediktor for dårlig sårheling, spesielt hos diabetikere.

I tillegg til de teknologiske fremskrittene har forskere også begynt å undersøke hvordan vertens immunsystem reagerer på GPAC-infeksjoner. Nøyaktige analyser av aktivering av neutrofiler og monocytter, samt deres inflammatoriske markører, har blitt avgjørende for å forstå vert-patogen-interaksjoner. Disse cellene er en del av kroppens første forsvarslinje, og deres reaksjon på bakterielle infeksjoner er essensiell for å forstå hvordan patogener som P. harei kan forårsake sykdom.

Studier av inflammatoriske markører på overflaten av immunceller som neutrofiler og monocytter gir ytterligere innsikt i hvor alvorlig infeksjonen er, og hvilke områder av immunsystemet som er mest påvirket. For eksempel har Peptoniphilus spp., som er vanlige i polymikrobielle infeksjoner, vist seg å øke uttrykket av CD66b på neutrofile celler, et kjent markør for aktivering. Dette kan være en indikator på at P. harei bidrar til en alvorlig immunrespons, noe som kan forklare dens patogenisitet.

Den praktiske tilnærmingen til å analysere slike responser kan utføres gjennom en rekke laboratorieteknikker. Ved hjelp av flowcytometri og ELISA-kits kan man kvantifisere spesifikke proteiner og markører på celleoverflaten, som for eksempel LL-37, et antimikrobielt peptid som produseres av vertens immunceller i respons på infeksjoner. Disse metodene gir ikke bare innsikt i de immunologiske reaksjonene på bakteriene, men de kan også hjelpe med å utvikle bedre diagnostiske verktøy for å identifisere og forstå infeksjonene forårsaket av anaerobe bakterier som P. harei.

Det er viktig å merke seg at behandlingen av infeksjoner forårsaket av P. harei fortsatt er utfordrende. Mangelen på etablerte behandlingsstandarder og den hyppige misidentifikasjonen av denne bakterien i kliniske settinger kan føre til forsinkede eller ineffektive behandlinger. Uten riktig diagnostikk og behandling kan dette føre til økt sykelighet og mortalitet, spesielt i pasienter med nedsatt immunforsvar eller andre underliggende helseproblemer.

Slik at helhetlig forståelse av vertens immunrespons er avgjørende. Det er viktig at leger og forskere ikke bare fokuserer på å identifisere bakterien, men også på å forstå hvordan den samhandler med immunsystemet. Dette kan hjelpe med å utvikle mer målrettede behandlingsstrategier som kan forbedre utfallet av pasienter med P. harei-infeksjoner.

Hvordan analysere dødsmekanismer i nøytrofiler under bakterieinfeksjoner

For å studere dødsresponsen i nøytrofiler under bakterieinfeksjoner, spesielt den regulerte celledød (RCD) og frigjøring av NETs (neutrophil extracellular traps), er det flere teknikker som kan brukes. En av de mest pålitelige metodene for å analysere slike prosesser er ved bruk av flow cytometri, kombinert med ulike fargestoffer og spesifikke markører for å differensiere mellom levende, døende og døde celler, samt for å fange opp frigjøring av NETs.

En typisk protokoll starter med opsonisering av bakteriene, som deretter tilsettes til cellene. For å utføre opsonisering, tilsettes 50 μL av en opsonisering løsning til μ-slide 8-hullsplaten, der bakteriene blir blandet med human plasma i RPMI 1640 medium. Dette kan inkludere både negative og positive kontroller, der sistnevnte kan involvere tilsetning av PMA (Phorbol Myristate Acetate) for å aktivere cellene. Etter inkubasjon i 20 minutter, kan bakteriene tilsettes nøytrofilene, og disse skal videre inkuberes under de passende forholdene (37°C med 5% CO2).

Etter tilsetning av fargestoffer som CD66b og 7-AAD, kan cellene vaskes og ytterligere inkuberes med 7-AAD og Annexin V for å vurdere apoptose og nekrose. Flow cytometriske analyser benytter også måling av signaler fra SYTOX grønne for å indikere tilstedeværelsen av NETs. Etter behandlingen med disse markørene, må det gjøres en omfattende analyse med hjelp av programvare som FlowJo for å bestemme antall og prosentandel av celler i ulike stadier.

I tillegg til flow cytometri, kan levende bildebehandling benyttes for å fange de dynamiske endringene i nøytrofilene under infeksjonen. Ved hjelp av fargestoffer som Hoechst 33342 og Sytox™ Green, kan cellemembranen og DNA-et i cellene visualiseres. Denne teknikken gir en mer visuell fremstilling av celledød og NETs-frigjøring, og gir forskerne en mulighet til å følge hendelsene i sanntid, og observere både apoptose og nekrose i nøytrofiler under infeksjon.

Det er viktig å merke seg at de spesifikke betingelsene for inkubasjon, som for eksempel tid, temperatur og konsentrasjon av bakteriene, spiller en betydelig rolle i resultatene av eksperimentene. Disse faktorene kan påvirke både hastigheten på celledød og omfanget av NETs-frigjøring, og derfor bør eksperimentelle parametere optimaliseres for å få pålitelige og reproducerbare resultater.

Analyser som disse gir innsikt i hvordan nøytrofilene reagerer på infeksjoner og hvordan de prøver å kontrollere bakteriell spredning, samtidig som de kan være involvert i vevsskade ved overdreven aktivering. Denne kunnskapen er essensiell for å utvikle målrettede behandlinger for infeksjoner, samt for å forstå immunologiske sykdommer hvor nøytrofilfunksjon er kompromittert.

Hvordan pneumokokkene fester seg til og invaderer nevroner: Eksperimentelle metoder og innsikter i patogenesen

Pneumokokkens evne til å feste seg til og invadere vertens celler er sentral for forståelsen av hvordan infeksjoner utvikler seg, særlig i sentralnervesystemet (CNS). Gjennom studier av bakterienes interaksjon med nevroner er det mulig å avdekke grunnleggende mekanismer som ligger til grunn for deres patogenese. Disse metodene gir et fleksibelt rammeverk som kan tilpasses ulike typer behandlinger, som kan omfatte antibiotika, peptider eller andre hemmere. Ved å bruke slike tilnærminger kan man undersøke vertens signalveier, intracellulære prosesser og hvordan bakteriene påvirker disse under pneumokokkinfeksjoner.

I nevroner har studier påpekt at β-aktin er en viktig mediator for pneumokokkens interaksjon med nevroner, men mange detaljer om hvordan pneumokokker fester seg og invaderer fortsatt gjenstår å avdekke. Hver pneumokokk-serotype bruker ulike strategier og proteiner for å oppnå adhensjon og invasjon, og mange av disse mekanismene er fortsatt ukjente. Det er derfor avgjørende å studere både adhesjon og invasjon for å forstå helheten i pneumokokkens patogenese.

Ved å benytte avanserte mikroskopiteknikker, som immunocytokjemisk farging og høyoppløselig konfokal mikroskopi, kan man visualisere disse interaksjonene på en detaljert måte. Selv om teknikker som STED-mikroskopi eller elektronmikroskopi gir større forstørrelse, forblir høyoppløselig konfokal mikroskopi den gullstandarde for å undersøke pneumokokk-vert-interaksjoner i både fast og levende vev.

Ved bruk av neuroblastomcellene SH-SY5Y, som kan differensieres til nevroner, kan forskere få et bedre innblikk i hvordan pneumokokker fester seg til og invaderer vertsceller. Dette er gjort mulig gjennom utvikling av spesifikke vekstmedier og infeksjonsprotokoller som etterligner forholdene i levende vev. Differensieringen av SH-SY5Y-celler til nevroner gjøres ved å tilsette retinolsyre, og disse cellene brukes deretter til å utføre adhesjons- og invasjonstester.

Invasjon og adhensjon undersøkes i laboratoriet ved å infisere cellene med pneumokokker i ulike forhold og deretter bruke forskjellige mikroskopiteknikker for å kvantifisere graden av infeksjon. Adhesjon vurderes ved å sammenligne bakterier som forblir bundet til cellene med de som ikke gjør det, mens invasjon vurderes ved å se på bakterier som har klart å trenge inn i cellene etter behandling med antibiotika som fjerner bakterier som kun er bundet utenpå.

For å sikre at observasjonene av interaksjonen mellom pneumokokker og nevroner er presise, benyttes også immunocytokjemiske metoder. Etter at cellene er festet og fiksert, benyttes spesifikke primær- og sekundærantistoffer for å merke de relevante molekylene og visualisere deres plassering i cellen. Denne metoden gir et sterkt verktøy for å undersøke hvordan pneumokokker påvirker vertens molekylære sammensetning.

En nøkkelfaktor i forståelsen av pneumokokkens virkningsmekanismer er å erkjenne at forskjellige pneumokokk-serotyper kan bruke forskjellige virulensfaktorer. Dette innebærer at ikke alle pneumokokker oppfører seg likt, og dermed kan behandlingsstrategiene variere. Forskningen på pneumokokkens adhesion og invasjon er derfor ikke bare viktig for å forstå hvordan infeksjonen oppstår, men også for utviklingen av nye behandlinger og vaksiner mot pneumokokk-relaterte sykdommer.

I tillegg til de spesifikke eksperimentelle metodene, er det viktig for forskere og helsepersonell å forstå at patogenesen ved pneumokokk-infeksjoner kan variere sterkt mellom individer, avhengig av immunsystemets respons og tilstedeværelsen av underliggende helseproblemer. Selv om laboratorieforsøk gir detaljert innsikt, kan den kliniske manifestasjonen av infeksjonen være langt mer kompleks. Dette understreker behovet for å videreutvikle både diagnostiske metoder og behandlingsmuligheter som tar høyde for de ulike måtene pneumokokkene kan påvirke verten på.