Hvordan kan biomarkører og molekylære mekanismer forbedre kreftdiagnostikk og behandling?

I moderne onkologi spiller biomarkører og molekylære modifikasjoner en stadig viktigere rolle i diagnostikk, prognose og behandling av kreft. Kreftceller gjennomgår komplekse genetiske og epigenetiske endringer, blant annet i DNA og histoner, som påvirker genuttrykk og celleatferd. Forståelsen av disse modifikasjonene, som beskrevet av Rothbart og Strahl, muliggjør en tolkning av kreftens «språk» på molekylært nivå, og gir grunnlag for mer presise behandlingstilnærminger.

Metabolitter assosiert med kreft, som Wang et al. har belyst, representerer lovende biomarkører i såkalte «liquid biopsies», der man analyserer kreftrelaterte molekyler i kroppsvæsker som blod. Dette åpner for mindre invasive diagnostiske metoder, som kan bidra til tidligere oppdagelse og bedre monitorering av sykdomsforløp. Suri og kolleger fremhever metabolomics som et dynamisk felt innen onkologi, der kartlegging av metabolsk profil kan gi innsikt i tumorenes heterogenitet og pasientspesifikk behandling.

Proteaser og deres rolle i kreftutvikling utgjør et særlig fokus. Disse enzymene regulerer blant annet kreftstamceller og deres mikromiljø, noe som Habič et al. har påpekt. Proteolyse, altså nedbrytning av proteiner, er en fundamentalt definert egenskap ved malignitet, og dens hemming kan åpne for terapeutiske muligheter, som vist i flere studier. Tumorens proteolytiske landskap er utfordrende, men avgjørende for å forstå kreftens progresjon og metastasering.

Videre er spesifikke biomarkører som MUC1 og MUC16 (CA125) identifisert som onkoproteiner med sentrale roller i tumorprogresjon og potensielle mål for målrettet terapi. Disse molekylene påvirker celleadhesjon, signalering og immunmodulering, og deres uttrykk kan også benyttes i diagnostikk og prognose. Kombinasjonen av genetiske mutasjoner, som i BRAF, og uttrykksnivåer av molekyler som TMPRSS4 mRNA gir økt nøyaktighet i preoperativ diagnostikk, spesielt ved usikre cytologiske funn i skjoldbruskkjertelknuter.

Skjoldbruskkjertelknuter utgjør et eksempel på kliniske utfordringer der økt bruk av ultralyd og fin-nålsaspirasjon har ført til økt diagnostisering av små, ofte klinisk ubetydelige papillære karsinomer. Dette har skapt debatt rundt overdiagnostikk og overtreatment. Aktiv overvåkning av lavrisiko mikrokarsinomer har vist seg som en forsvarlig strategi, noe Ito og Miyauchi har dokumentert gjennom studier.

Betydningen av genetisk testing ved usikre cytologiske resultater understrekes for å redusere unødvendige operasjoner og tilpasse behandling. Nye molekylære paneler, som Thyroseq v3 og Afirma GSC, forbedrer differensiering mellom benigne og maligne lesjoner, og bidrar til personlig tilpasset medisinsk praksis.

Det er også viktig å forstå at kreft ikke bare er en sykdom i enkeltceller, men en dynamisk prosess hvor tumorens mikromiljø, immunrespons og proteolytisk aktivitet i stor grad bestemmer sykdomsforløpet. Mellman og kolleger har fremhevet kreft-immunitets-syklusen som en nøkkel til å forstå og utvikle immunterapier.

For leseren er det avgjørende å anerkjenne at kreftdiagnostikk og behandling ikke lenger er basert utelukkende på histologi og kliniske funn, men krever en integrert tilnærming hvor molekylære biomarkører, genetikk, proteomikk og metabolomics inngår. Den teknologiske utviklingen har åpnet muligheter for mer skreddersydd behandling, men samtidig skapt nye utfordringer knyttet til tolkning av komplekse data og balansering mellom intervensjon og overbehandling.

Det er også vesentlig å være oppmerksom på at tumormikromiljøet, inkludert proteaser og fibrosemedierende faktorer som HE4, spiller en sentral rolle i sykdomsprogresjon og behandlingsresistens. Dette understreker behovet for å utvikle terapier som ikke bare retter seg mot selve kreftcellene, men også mot deres omgivende støttevev og immunregulering.

Forståelsen av molekylære og cellulære mekanismer bak kreft er dynamisk og stadig under utvikling. Derfor krever klinisk praksis kontinuerlig oppdatering basert på den nyeste forskningen, slik at pasientbehandling kan optimaliseres og individualiseres i takt med teknologiske fremskritt og økende biologisk innsikt.

Hvordan muliggjør nye teknologier tidligere og mer presis diagnostikk av HCC?

I jakten på tidlig diagnostisering av hepatocellulært karsinom (HCC) har forskningen beveget seg inn i mikroskopiske og molekylære landskap hvor konvensjonelle blodprøver ikke strekker til. En presis og sensitiv diagnostikk krever metoder som både kan isolere og identifisere minimale biologiske signaler blant komplekse biologiske matrikser som plasma. Det er i dette landskapet ekstracellulære vesikler (EVs) og digital scoring har fått et gjennombrudd.

Prosessen begynner med en bevisst manipulering av cellemiljøet in vitro. Celler dyrkes i serumfritt medium i opptil 48 timer for å tvinge dem til å skille ut vesikler i mediumet. Etterpå isoleres EVs gjennom en sekvens av sentrifugeringer – først ved lav hastighet for å fjerne celler og større rester, deretter ved høyere hastighet for å eliminere mikroskopisk rusk. Til slutt utsettes prøvene for ultracentrifugering ved 100 000 × g, hvor EV-pellets skilles ut og suspenderes i PBS. Disse EV-pellets tjener som kilden til molekylær signatur i det videre diagnostiske arbeidet.

For å simulere realistiske diagnostiske betingelser tilsettes EV-pellets i plasma fra enten friske donorer eller pasienter med skrumplever. Pasientplasma samles ved standardiserte protokoller, hvor fullblod behandles i EDTA-rør og sentrifugeres i to trinn for å separere plasmaet, som deretter lagres ved –80 °C frem til analysene gjennomføres.

Et essensielt verktøy i denne diagnostiske metodologien er GALAD-scoren – en matematisk modell som kombinerer kjønn, alder, samt biomarkørene AFP, AFP-L3% og DCP for å gi en sannsynlighet for HCC. GALAD = –10.08 + 1.67 × (kjønn) + 0.09 × (alder) + 0.04 × (AFP-L3%) + 2.34 × log(AFP) + 1.33 × log(DCP). Validert i store amerikanske kohorter, har denne scoringsmodellen vist betydelig prediktiv verdi, særlig i tidlige stadier av sykdommen hvor tradisjonell avbildning ofte feiler.

Men den virkelige innovasjonen ligger i kombinasjonen av EV-teknologi og molekylær analyse. Den såkalte HCC EV Digital Scoring Assay gjennomføres i to trinn. Først anvendes en mikroflytende plattform kalt EV Click Chip for å selektivt fange opp EVs som uttrykker spesifikke overflateproteiner assosiert med HCC – EpCAM, ASGPR1 og CD147 – via antistoffer koblet til TCO-grupper. Deretter frigjøres EVs kjemisk ved injeksjon av DTT og samles for RNA-ekstraksjon.

Neste trinn er absolutt kvantifisering av ti HCC-spesifikke mRNA-markører via RT-ddPCR (reverse transcription droplet digital PCR). RNA isoleres, konverteres til cDNA og fordeles på flere reaksjonsrør med fluorescensfiltre. Hver prøve analyseres i dråpebasert PCR-system, hvor hver dråpe fungerer som en individuell reaksjonsenhet. Resultatene gir et digitalt utslag som kan kvantifisere tilstedeværelsen av kreftrelaterte mRNA med ekstrem presisjon, selv ved svært lave nivåer.

Parallelt anvendes en komplementær metode: HCC EV Surface Protein Assay. Denne prosedyren skjer i tre trinn og benytter seg av en annen innovativ teknologi kalt Click Beads. Her merkes EV-subpopulasjoner med to sett av antistoffer – ett rettet mot HCC-assosierte overflateproteiner (EpCAM, GPC3, CD147, ASGPR1), og ett sett med DNA-kodede EV-markører (CD63 og CD9). De DNA-konjugerte antistoffene tillater videre kvantifisering gjennom real-time immuno-PCR, en metode hvor signalet amplifiseres og leses i sanntid.

Et viktig aspekt ved disse metodene er at de ikke bare muliggjør påvisning, men også subklassifisering av EVs, noe som gir informasjon om heterogeniteten i tumormassen – et fenomen med direkte implikasjon for prognose og valg av behandling.

Klinisk validering av disse teknologiene er gjennomført i fase 2 studier med strengt definerte case-kontroll design. Bare pasienter med ubehandlet HCC (BCLC 0-A) ble inkludert, og kontrollgruppen bestod av skrumpleverpasienter som fulgte standard retningslinjer for HCC-screening. Denne strenge inndelingen er avgjørende for å unngå overestimering av metodens sensitivitet og spesifisitet.

Disse teknologiene understreker et paradigmeskifte i diagnostikk: fra enkle serologiske markører til multidimensjonale digitale biomarkører, fra bulkbaserte analyser til enkelt-vesikkel- og enkelt-molekylnivå. Det er ikke bare et spørsmål om tidligere påvisning, men om mer presis stratifisering av pasienter – en nødvendig forutsetning for personlig tilpasset medisin.

Det som også er viktig å forstå, er at påliteligheten av slike metoder ikke bare hviler på teknologien i seg selv, men også på preanalytiske faktorer – kvaliteten på prøvemateriale, fryse-tine-syklus

Hvordan opprettholde og analysere organoidkulturer for effektiv forskning

Organogene kulturmodeller gir en unik mulighet for å studere komplekse vevsmikrostrukturer og celleinteraksjoner i et kontrollert laboratorium. En av de mest anvendte tilnærmingene i forskning på tarmens fysiologi og patologi er bruken av tarmorganoider. Disse modellene, som opprettes ved å isolere stamceller fra tarmvev og dyrke dem i en tre-dimensjonal (3D) matrisemiljø, etterligner de naturlige egenskapene til tarmvev. Den prosessen der organoider dannes, differensieres og vedlikeholdes, er avgjørende for å forstå deres potensial som modeller for ulike sykdommer, som tarmkreft eller inflammatoriske tarmsykdommer.

I starten av kultiveringsprosessen blir epitelceller fra tarmvev isolert og deretter sentrifugert ved 290 g i tre minutter ved 4 °C for å separere cellene fra mediumet. Det supernatante væsken fjernes forsiktig, og cellene gjenoppløses i en blanding av standard organoidvekstmedium og Matrigel. Denne blandingen blir deretter plassert i 48-hullsplater og tillates å størkne i inkubatoren i 10–20 minutter ved 37 °C. Etter at Matrigelen er størknet, tilsettes 500 µl organoidvekstmedium til hvert brønn, og platen inkuberes videre ved 37 °C med 5 % CO2. Hver 2–3 dagene byttes mediumet, noe som krever forsiktig fjerning av det gamle mediumet og tilsetning av nytt, oppvarmet medium. Det kan ta mellom 9–12 dager for humane organoider og 6–9 dager for museorganoider å danne komplekse, flerlobede strukturer.

Når de primære organoidene har blitt etablert, isoleres de for videre passering. Passeringen innebærer tilsetning av TrypLE, som inkuberes i minst fem minutter for å dissosiere organoidene til enkeltceller. Etter sentrifugering ved 290 g i tre minutter ved 4 °C, fjernes supernatanten, og cellene resuspenderes i kultursmedium. Deretter telles cellene, og omtrent 100 organoider resuspenderes i Matrigel og plasseres på de forvarmede kulturplatene. Etter at Matrigelen har størknet, tilsettes forvarmet medium i hvert brønn, og platen plasseres deretter i en fuktig inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 for videre vekst.

For å vurdere morfologien til organoidene, brukes H&E-farging, som gir en detaljert oversikt over strukturen til organoidene. Ved immunofluorescens (IF) kan man analysere uttrykket av spesifikke differensieringsmarkører som Muc2 (for gobletceller) og Krt20 (for epitelceller). Disse markørene indikerer hvordan organoidene gjennomgår differensiering til funksjonelle celletyper, noe som er avgjørende for deres relevans som modeller i medisinsk forskning.

Bilder av organoidene tas ved hjelp av konfokalmikroskopi, og bildene blir deretter analysert med bildebehandlingsverktøy som ImageJ. En viktig vurdering i bildene er antallet kryptdomener, som er klart definerte utstikkende strukturer, og lengden på grener som utvikles i organoidene under kultivering. For kvantitativ analyse av genuttrykk i organoidene benyttes RT-qPCR for å måle endringer i genuttrykk som er relevante for tarmfunksjon og differensiering. Primere for ulike gener som Gapdh, Axin2, Lgr5, Krt20, og Muc2 brukes for å undersøke uttrykket av spesifikke tarmcellemarkører.

Det er avgjørende at forskeren ikke bare vurderer den morfologiske utviklingen av organoidene, men også deres funksjonelle egenskaper. I vår erfaring tar det omtrent fem til syv dager før organoidene når et modenhetsnivå der de inneholder godt differensierte celler og viser et utviklet mønster av organoidvekst. Dette gjør at organoidene kan brukes til videre eksperimentering og testing av ulike behandlingsstrategier eller sykdomsmodeller.

Det er også viktig å vurdere hvordan organoidene er plassert i matrisen for å sikre at de utvikler seg på riktig måte. For eksempel, hvis organoidene ikke er riktig plassert i matrisen, kan de adoptere en polygonal form i stedet for å danne den karakteristiske 3D-strukturen med knoppdannelse som er typisk for tarmepitel. Slike avvik kan påvirke resultatene av eksperimentene, og derfor er det nødvendig med nøye optimalisering av kulturforholdene for å sikre pålitelige og repeterbare resultater.

Videre, når organoidene vokser og utvikles, er det avgjørende å forstå hvordan forskjellige faktorer påvirker deres vekst og differensiering. For eksempel, når organoidene kultiveres for lenge, kan de begynne å vise tegn på degenerasjon, som for eksempel tykkere vegger og akkumulering av avfallsprodukter i lumenet. Dette indikerer at organoidene ikke bare utvikler seg til et funksjonelt tarmvev, men også at det er en prosess med naturlig cellenedbrytning som kan informere om organiske sviktprosesser eller sykdomsprogresjon i et forskningsscenario.

Hvordan Mutasjoner i UVRAG Påvirker Tidlig Krebscelleutvikling i Kolon Organoider

I studier av kolonsystemet har organoidmodellen vist seg å være et effektivt verktøy for å forstå både normalt cellefornyelse og den patologiske utviklingen som skjer ved mutasjoner i spesifikke gener. En av de mest interessante mutasjonene for kreftforskning er UVRAG, som spiller en kritisk rolle i reguleringen av tumorsprengning og modning av celler. Ved å bruke mus og pasientbaserte organoidmodeller har forskere fått innsikt i hvordan denne mutasjonen kan påvirke både den normale cellefornyelsen og begynnelsen på tumorutvikling i kolon.

Tidligere studier har vist at UVRAG (UV radiation resistance-associated gene) er nært knyttet til genetisk ustabilitet og kreftprogressjon, spesielt hos pasienter med mikrosatellitt-instabilitet (MSI). En nylig gjennomført eksperimentell studie benyttet en organoidmodell utviklet fra mus med UVRAG-mutasjonen for å etterligne de tidlige tumorfenomenene som kan oppstå i menneskelig kolon. Organoider, som er miniatyriserte versjoner av organer dyrket i laboratoriet, viste en interessant oppførsel når de ble eksponert for muterte UVRAG-gener.

Etter seks dager i kultur viste villtype organoider utvikling av krypt-lignende strukturer, et tegn på normal differensiering. Imidlertid forble organoidene fra UVRAG-musene i en unormalt stor, cystisk form og utviklet ikke de typiske kryptstrukturene. Denne mangelen på differensiering kan indikere en tidlig blokkering i cellenes utvikling, et fenomen som er karakteristisk for kreftceller.

Videre ble det utført kvantitative RT-PCR-analyser for å vurdere ekspresjonen av stemcellemærkere (LGR5 og AXIN2) samt differensieringsmarkører (MUC2 og KRT20). Resultatene viste en betydelig økning i stemcellemærkerne LGR5 og AXIN2 i UVRAG-organoider, mens markørene for differensiering (MUC2 og KRT20) var nedregulert. Dette er i samsvar med tidligere funn som indikerer at uttrykk av UVRAG kan forstyrre normal differensiering og fremme kreft-lignende fenotyper i organoidmodellen.

Videre ble det gjort forsøk med pasientbaserte organoider for å validere de eksperimentelle funnene. Organotypiske kulturer utviklet fra vevsprøver fra pasienter med UVRAG-mutasjonen viste en lignende forsinkelse i differensiering og dannelse av kryptlignende strukturer. Slike organismer var i stand til å opprettholde sine genetiske egenskaper gjennom passasjer i kulturen, og deres vekst mønstret de samme blokkeringene i utvikling som ble sett i musestudiene. Pasientens organoider oppviste også en karakteristisk overuttrykkelse av stemcellemærker og en signifikant reduksjon i differensieringsmarkører, noe som indikerer at UVRAG-mutasjonen kan føre til en tidlig ubalanse i stemcellens differensieringsprosesser.

Disse observasjonene har viktige kliniske implikasjoner. Å identifisere tidlige tegn på differensieringsblokker før tumoren er fullt utviklet kan gi muligheter for å oppdage kreft på et tidlig stadium, noe som potensielt kan forbedre behandlingsresultatene. Organoider kan således tilby en praktisk og pålitelig metode for å modellere tidlig kreftutvikling og test av terapeutiske strategier.

Videre forskning på organoidene bør fokusere på å analysere deres plastisitet og heterogenitet for å bedre forstå hvordan tidlige celler som har mistet differensiering, kan initiere og forsterke kreftutviklingen. Det er viktig å utforske hvordan andre genetiske mutasjoner, i tillegg til UVRAG, kan påvirke denne prosessen og om spesifikke terapier kan reversere tidlige differensieringsblokker før de fører til full kreftutvikling.

Samlet sett gir denne forskningen et kraftig verktøy for å forstå de tidlige mekanismene bak tumorutvikling og kan være avgjørende for utviklingen av nye metoder for tidlig kreftdiagnostikk og behandling.

Hvordan oppstår og oppdages metastaser ved brystkreft: utfordringer og nye innsikter

Metastatisk spredning av brystkreft er ikke et tilfeldig fenomen, men et resultat av nøye orkestrerte prosesser i tumorens mikromiljø, hvor såkalte TMEM-strukturer (Tumor MicroEnvironment of Metastasis) spiller en sentral rolle. Disse mikroskopiske døråpningene i karveggen tillater kreftceller å forlate primærtumoren og entre blodbanen. Studien publisert i Science Translational Medicine (2017) dokumenterer hvordan kjemoterapi, til tross for sin cytotoksiske hensikt, paradoksalt nok kan indusere metastase ved å øke dannelsen og aktiviteten til TMEM-døråpninger. Dette skjer gjennom rekruttering av spesialiserte Tie2-høytuttrykkende makrofager, som aktiverer endotelcellene og gjør karveggen permeabel for tumorceller.

Rebastinib, en selektiv Tie2-inhibitor, har vist seg å kunne blokkere denne prosessen. I eksperimentelle modeller reduserte behandlingen betydelig antallet TMEM-døråpninger og dermed potensialet for metastase. Dette åpner for et nytt terapeutisk paradigme der man målretter støttestrukturer i mikromiljøet fremfor selve kreftcellene.

Studier av både primære brysttumorer og lymfeknutemetastaser viser at TMEM-døråpninger utelukkende er lokalisert til blodkar-endotel, og aldri i lymfatiske strukturer. Dette antyder at hematogen spredning er hovedruten for TMEM-mediert metastase, og reiser spørsmål ved nytten av utelukkende å fokusere på lymfeknuter som prediktiv indikator.

Det er også utviklet kvantitative metoder for å vurdere TMEM-tetthet i tumorvev, både i levende modeller via intravital mikroskopi og i formalinfiksert, parafininnstøpt materiale. Digitale patologisystemer som QuPath muliggjør presis og objektiv scoring, og viser lovende som prognostisk verktøy. Valideringen av slike digitale metoder viser sterk korrelasjon med manuell vurdering, og baner vei for mer standardisert bruk i klinisk praksis.

Makrofagenes rolle i kreft er under full revurdering. De er ikke kun tilstede som immunceller, men aktivt medskapende i tumorvekst, immunundertrykkelse og ikke minst i initieringen av metastase. Responsen på kjemoterapi kan i seg selv påvirke makrofagenes fenotype og funksjon, noe som kan forklare hvorfor enkelte behandlinger utilsiktet øker risiko for fjernspredning.

Bruken av MR for å estimere metastatisk risiko og for å identifisere pasienter med høy TMEM-tetthet før kjemoterapi er et annet område i rask utvikling. Resultater fra NPJ Breast Cancer (2022) viser at kjemoterapiindusert økning i TMEM kan estimeres radiologisk, og dermed potensielt informere behandlingsvalg før terapien settes i gang.

Samtidig blir det stadig tydeligere at genetisk bakgrunn og rase påvirker både behandlingsrespons og langtidsutfall. Store randomiserte studier har dokumentert ulikheter i respons blant pasienter med hormonreseptorpositiv brystkreft, hvor afroamerikanske kvinner oftere har dårligere prognose, selv under identiske behandlingsregimer. Mikromiljøets sammensetning, inklusive tetthet av TMEM og makrofagaktivitet, viser seg også å være forskjellig mellom etniske grupper, noe som utfordrer forestillingen om universelle biomarkører og terapier.

På et mer grunnleggende nivå oppstår spørsmålet: hvordan kan så mange mikroskopiske metastatiske prosesser gå uoppdaget i klinisk praksis, særlig når det gjelder tidlig diagnostikk? En sentral begrensning ved dagens radiologiske praksis er den høye forekomsten av visuelle feil – spesielt “misses”. Selv erfarne radiologer kan overse små lungenoduli, til tross for at disse kan være til stede på tidligere bildeserier. Det antas at over halvparten av diagnostiserte lungekrefttilfeller kunne vært oppdaget et år tidligere, dersom nodulene ikke hadde blitt oversett. Det visuelle søket i radiologi – kjent som Diagnostic Visual Search (DVS) – er en kompleks kognitiv prosess som avhenger av målrettet øyebevegelse, oppmerksomhetsallokering og sammenligning av visuelle trekk.

Dersom en struktur i et bilde deler visuelle trekk med det man leter etter, øker sannsynligheten for at øyet fester seg ved det området. Men når det er uklart hva man leter etter, eller om man i det hele tatt burde lete, faller søkeeffektiviteten dramatisk. Når bilder er dynamiske, tidspresset høyt og abnormaliteter subtile, som ofte i klinisk virkelighet, svekkes den diagnostiske presisjonen ytterligere.

Den kognitive belastningen på radiologer er betydelig, og antall feil synes ikke å ha forbedret seg vesentlig på 60 år. Dette peker på behovet for systematiske endringer, ikke bare i teknologi, men også i forståelsen av hvordan mennesker faktisk sanser, tolker og reagerer på visuell informasjon i komplekse miljøer.

Det som er avgjørende å forstå, er at både metastase og diagnostiske feil ikke oppstår tilfeldig, men er konsekvenser av underliggende biologiske og kognitive systemer. Kjemoterapi er ikke nødvendigvis nøytral eller alltid fordelaktig – den kan aktivere prosesser som fremmer spredning. Og samtidig er ikke fraværet av deteksjon det samme som fraværet av sykdom. Radiologi er ikke en perfekt linse mot kroppen – det er en tolkning underlagt menneskelig begrensning. Innsikt i begge disse domenene – mikromiljøets biologi og det visuelle søkets psykologi – er nødvendig for å utvikle mer presise, rettferdige og effektive kreftbehandlinger i fremtiden.