Hvordan fungerer spektroskopi og instrumentering i analytiske teknikker?

Spektroskopi er en metodikk som gjør det mulig å studere og analysere stoffers sammensetning og struktur ved å undersøke hvordan de absorberer eller emitterer elektromagnetisk stråling. Hver substans har et unikt sett med energinivåer som bestemmer hvilke frekvenser av stråling som kan absorberes eller sendes ut. Denne egenskapen utnyttes for å skaffe både kvalitativ og kvantitativ informasjon om et stoff, hvor posisjonene og intensitetene til spektrallinjene gir innsikt i sammensetningen.

En viktig egenskap ved spektroskopi er at intensiteten til en spesifikk linje eller bånd er direkte proporsjonal med antallet atomer eller molekyler som gjennomgår en overgang. Denne relasjonen gjør spektroskopi til et verdifullt verktøy i analytiske teknikker, hvor det ikke bare er den kvalitative analysen av stoffets sammensetning som er viktig, men også den kvantitative analysen som kan gi presise målinger av stoffets mengde.

Når vi ser på instrumenteringen som benyttes i spektroskopi, vil det være tydelig at det finnes mange forskjellige typer apparater som brukes til å generere stråling, analysere spekteret og måle intensiteten. Til tross for at de tekniske detaljene kan variere, deler alle spektrometriske enheter noen grunnleggende funksjoner. En spektrometer har typisk tre hovedfunksjoner: å produsere stråling med passende frekvenser for energiovergangene i prøven, å undersøke spekteret for å utføre kvalitativ analyse, og å måle intensiteten av stråling ved bestemte frekvenser for å gjøre kvantitativ analyse.

Det finnes flere måter å produsere denne strålingen på. I enklere spektroskopiske teknikker benyttes ofte filtre som selektivt absorberer alle unntatt et bestemt frekvensområde, en metode kjent som filterfotometri. Dette er en enkel, men lite fleksibel tilnærming, da det kan være vanskelig å lage filtre med tilstrekkelig smal transmisjon. Derfor benyttes filtre i hovedsak i enklere instrumenter hvor nøyaktigheten ikke er kritisk.

En mer avansert tilnærming er bruken av et monochromator, som fungerer ved å separere eller spre strålingen spatialt. Dette kan gjøres ved hjelp av et prisme eller et diffraksjonsgitter som bøyer strålingen ved ulike vinkler avhengig av dens frekvens. Dette systemet gjør det mulig å isolere bestemte bølgelengder og analysere dem individuelt. I mer sofistikerte spektrometre brukes et spektralt slit for å lede strålingen gjennom, og ved å rotere prismet eller diffraksjonsgitteret kan man fange opp stråling med ulike bølgelengder i et kontinuerlig spektrum.

En annen viktig komponent i spektrometere er analysatoren. Denne enheten sørger for at det oppnås mono­kromatisk stråling ved å selektere spesifikke frekvenser som deretter kan analyseres i detalj. Prismatiske monokromatorer er ofte brukt i billigere instrumenter, hvor de bryter polykromatisk lys i forskjellige vinkler, avhengig av strålingens frekvens. Dette fører til at høyfrekvente lysstråler avbøyes i større vinkler enn lavfrekvente, noe som skaper et spektrogram hvor høyfrekvente linjer ser mer spredte ut enn lavfrekvente.

På den andre siden, for instrumenter som opererer i ultrafiolett, synlig og infrarød bølgelengde, benyttes ofte diffraksjonsgitter som har flere parallelt kutte spor for å skape en høyere presisjon i spredningen av strålingen. Holografiske gitter er foretrukket fremfor mekanisk kutte, da de gir mindre ‘strålingsstøy’ og dermed en mer lineær respons i målinger av absorpsjon som funksjon av konsentrasjon.

Det er også viktig å forstå at spektroskopiske teknikker kan benytte seg av både én- og dobbeltbjelkebasis. En dobbeltbjelkebasis gjør at strålingen som absorberes eller sendes ut av prøven sammenlignes automatisk med en standard eller tom prøve (blank), noe som bidrar til å korrigere for støy eller endringer i instrumentet over tid. Denne tilnærmingen gjør dataene mer pålitelige og gir et nøyaktig bilde av stoffets egenskaper.

Når man vurderer spektroskopiske instrumenter som hele, kan man se at de er bygget på de samme fundamentale prinsippene, men tilpasset forskjellige teknikker og formål. For eksempel vil et røntgenfluorescensapparat (XRF) og en flammefotometer være konstruert forskjellig, men begge har til hensikt å produsere stråling som interagerer med prøven på en spesifikk måte for å generere spektrale data.

For leseren som ønsker å utforske spektroskopi videre, kan det være nyttig å forstå hvordan ulike instrumenter er optimalisert for spesifikke målinger. Det er viktig å vite hvilke faktorer som påvirker nøyaktigheten av målingene, for eksempel hvilken type stråling som benyttes (røntgen, ultrafiolett, synlig, infrarød), hvilke materialer som benyttes i analysatorene, og hvordan kalibrering og standardisering av instrumentene er avgjørende for nøyaktige resultater. Ulike metoder kan være mer eller mindre egnet avhengig av stoffene som analyseres, og derfor er det viktig å forstå hvilken teknikk som er best egnet for en spesifikk type analyse.

Hvordan bruke UV-absorpjonsspektroskopi for kvantitative og kvalitative analyser

Ultrafiolett (UV) og synlig spektroskopi er kraftige verktøy innen analytisk kjemi. Disse teknikkene tillater forskere å identifisere og kvantifisere organiske og uorganiske forbindelser basert på deres evne til å absorbere lys i det ultrafiolette og synlige spekteret. Spesielt brukes UV-spektroskopi ofte for å analysere aromatiske og konjugerte organiske forbindelser samt komplekse uorganiske ioner. Det finnes omfattende tabeller over absorpsjonsregioner for forskjellige funksjonelle grupper som kan være nyttige når man tolker spektrene.

En viktig del av analysen er kvalitativ sammenligning av spektra, som kan gjøres ved å sammenligne et ukjent spektrum med et kjent, enten i laboratoriet eller ved å bruke spektra fra litteraturen. Kommersielle kataloger med spektralkurver fra det synlige og ultrafiolette området er tilgjengelige og kan være svært nyttige i dette arbeidet. Det er også viktig å merke seg at prosent transmittanse ikke er en lineær funksjon, mens absorpsjon er lineær i forhold til konsentrasjonen. Derfor fokuserer vi på absorpsjonsspektra for mer presise analyser.

Et eksempel på hvordan forskjellige konsentrasjoner av et stoff påvirker absorpsjonsspektra, kan sees i figurene som viser absorpsjon mot bølgelengde. Når man ser på disse kurvene, kan man finne at det er vanskelig å gjøre kvalitative sammenligninger på grunn av formendringene som skjer når konsentrasjonen endres. Ved å plotte log-absorpsjon mot bølgelengde, vil kurvene forskyves likt, noe som gjør det lettere å sammenligne spektrene til identiske løsninger på forskjellige konsentrasjoner. Dette kan også oppnås ved å bruke en semilogaritmisk skala, som vil gi samme resultat.

I analysen av to kjemiske arter som eksisterer i likevekt, som for eksempel et syre-base-indikatorpar, kan man finne et spesifikt punkt i spektrumet der absorbansene for begge arter er like. Dette punktet kalles et isosbestisk punkt og er et viktig bevis på at to interkonvertible arter eksisterer i likevekt. Isosbestiske punkter forekommer ofte i oksidasjons-reduksjonsreaksjoner, chelateringsprosesser og i syre-base-likevekt. Når slike punkter identifiseres, kan man bruke dem til å bestemme forholdet mellom de to artene og dermed få viktig informasjon om systemet.

Et annet viktig aspekt ved UV-spektroskopi er bestemmelsen av pK og pH i syre-base-systemer. I en løsning som inneholder en syre-base-indikator, kan man, ved å variere pH, få frem en rekke absorpsjonskurver som reflekterer endringene i konsentrasjonen av syre og base. Dette gir en mulighet til å bestemme pK for indikatoren, som er et mål for hvor lett indikatoren bytter mellom syre- og baseformene. Ved å plotte absorpsjonen ved spesifikke bølgelengder mot pH, kan man bestemme pK-verdien og bruke denne informasjonen til å beregne pH for ukjente løsninger.

Når det gjelder komplekse ioner og metallchelater, finnes det flere spektrofotometriske metoder for å bestemme den kjemiske formelen. De to mest brukte metodene er molekylforhold-metoden og metoden for kontinuerlige variasjoner. Selv om disse metodene ikke nødvendigvis vil bli utdypet her, er det viktig at leseren er oppmerksom på deres eksistens og potensielle anvendelser i mer avanserte analyser.

Fotometriske titreringer er en annen teknikk som bruker spektroskopi til å bestemme ekvivalenspunktet i en titrering. I slike titreringer kan man bruke et reagens eller produkt som absorberer lys, eller et absorpsjonsindikator, for å oppdage ekvivalenspunktet. I en fotometrisk titrering plotter man absorbansen, korrigert for volumforandringer, mot volumet av titranten som tilsettes. Kurven som oppstår, vil typisk ha to lineære områder med forskjellige stigninger, hvor det ene området skjer før ekvivalenspunktet og det andre etter. Endepunktet finnes ved å ekstrapolere de lineære delene av kurven.

For å få nøyaktige titreringsresultater er det viktig at det absorberende systemet følger Beer's lov. Ellers vil titreringens kurve mangle de nødvendige lineære områdene for å finne ekvivalenspunktet. Absorpsjonen må også korrigeres for volumendringer, noe som oppnås ved å multiplisere de observerte verdiene med (V + v)/V, hvor V er volumet på løsningen før titrering og v er volumet av den tilførte titranten.

Det er viktig å huske at UV-spektroskopi og fotometriske titreringer ikke bare er verktøy for å identifisere og kvantifisere kjemiske stoffer, men også for å studere kjemiske reaksjoner og likevekter i dybden. Gjennom disse metodene kan man få detaljert innsikt i både kjemiske mekanismer og de spesifikke forholdene som styrer reaksjonene. Når disse teknikkene brukes riktig, gir de et kraftig verktøy for nøyaktige og pålitelige kjemiske analyser.

Hvordan velge og bruke kalibreringskurver for spektroskopiske målinger

Når man arbeider med spektroskopi, er valget av riktig bølgelengde en avgjørende faktor for nøyaktigheten og følsomheten av målingene. Et av de første trinnene etter å ha justert instrumentet, er å bestemme hvilken bølgelengde som gir best resultat for det studerte systemet. Dette avhenger ikke bare av absorpsjonskapasiteten til forbindelsen, men også av interferenspotensialet og slitasjebredden. For eksempel, til tross for at forbindelsen har høyere absorptivitet ved bølgelengdene A og F, kan disse fordelene gå tapt når interferens og bredde på spalten tas i betraktning. Punkt B, som kan ha en lavere absorpsjonskapasitet, viser seg derfor å være det beste valget når en bandbredde på 20 nm benyttes.

Når bølgelengden er valgt, og instrumentet er justert, er neste steg å sikre at systemet følger Beers lov. Dette innebærer en rekke nøye utførte prosedyrer som sikrer at de målte absorbansene er i samsvar med lovens prediksjoner.

Først må man forberede en serie standardløsninger som dekker det ønskede konsentrasjonsområdet. Sammensetningen av løsningene bør være så nær som mulig den aktuelle systemets sammensetning, og de bør gi absorbansmålinger i den nedre delen av feilkurven. Om det er kjent at prøvene inneholder forurensninger eller potensielle interferensstoffer, bør disse også inkluderes i standardene. Deretter må en blank løsning forberedes og kalibreres. Det er viktig at den er korrekt forberedt, da en feilaktig blank kan føre til unøyaktige resultater.

Videre, når bølgelengden er satt, skal transmittansen på 0 % justeres med lukkeren stengt, og transmittansen på 100 % med lukkeren åpen og blanken i den optiske banen. Når dette er gjort, må man måle absorbansen ved ulike konsentrasjoner av standardene. Ved å plotte absorbansene mot konsentrasjonen, kan man visuelt bekrefte at systemet følger Beers lov, der den ideelle kalibreringskurven er en rett linje som går gjennom origo.

Teoretisk kan konsentrasjonen av en ukjent prøve bestemmes ved å lese dens absorbans og finne den tilsvarende konsentrasjonen på kurven. Denne prosessen kan også utføres matematisk ved bruk av Beers lov, som er uttrykt i ligningene:

Der $A$ er absorbansen, $\varepsilon$ er absorptiviteten, $b$ er banens lengde, og $c$ er konsentrasjonen av løsningen. For den ukjente prøven, vil en lignende ligning gjelde:

Kombineringen av disse ligningene gir en enkel løsning der absorbansen er direkte proporsjonal med konsentrasjonen, forutsatt at absorptiviteten og banens lengde er like for både standardene og den ukjente prøven.

Imidlertid kan valget av et punkt på kurven som ikke ligger på linjen føre til feilaktige resultater. For å redusere denne feilen, kan man bruke statistiske teknikker som lineær regresjon for å inkludere flere datapunkter. Men på grunn av andre feilkilder i prosedyren, kan ikke alltid slike teknikker anses som praktiske.

En annen utfordring kan oppstå hvis blanken ikke er riktig forberedt, og derfor absorberer mindre enn den burde. Dette kan føre til en feilaktig y-intersept på kurven. I slike tilfeller må den målte absorbansen korrigeres for å ta hensyn til blankens absorbans.

En annen metode for å bruke spektroskopi, til tross for at vi har fokusert på monokromatisk lys, er bruken av hvitt lys. Selv om metodene som benytter hvitt lys generelt ikke er like presise som de som benytter monokromatisk lys, kan de være tilstrekkelige for enkelte applikasjoner. I disse tilfellene benyttes det menneskelige øye som deteksjonsenhet, og intensiteten til fargen i den ukjente løsningen sammenlignes med intensiteten til samme farge i en standard. Denne sammenligningen kan utføres direkte ved hjelp av standardserie-metoden, eller ved å matche intensitetene ved å endre enten konsentrasjonen eller veiens lengde.

I standardserie-metoden forberedes en serie standardløsninger som dekker konsentrasjonsområdet til den ukjente prøven, og disse sammenlignes i transparente beholdere som testtuber. Om nøyaktig match ikke oppnås, kan forskjeller estimeres. Denne metoden er sjelden brukt med mindre et stort antall bestemmelser i et smalt konsentrasjonsområde er nødvendig.

En annen metode er fortynningsmetoden, hvor to celler eller testtuber sammenlignes, og den løsningen som har høyere konsentrasjon fortynnes til fargene i begge cellene er like. Denne metoden innebærer beregning av den ukjente konsentrasjonen ved hjelp av Beer’s lov, og fortynningsfaktorer.

Til slutt finnes også Duboscq® Colorimeter, hvor veiens lengde varieres i stedet for konsentrasjonen. Dette apparatet har to celler med justerbare stempler som kan beveges opp og ned i løsningene, og lyset som passerer gjennom cellene projiseres til et okularet. Intensiteten i de to halvdelene sammenlignes for å bestemme konsentrasjonen.

I tillegg til valget av riktig bølgelengde og kalibrering, er det viktig å vurdere systemets følsomhet, potensielle interferensfaktorer, og nøyaktigheten ved målingene. Beers lov forutsetter en rekke ideelle forhold, som konstant absorptivitet og jevn bane-lengde, men i praksis kan variasjoner i prøven, feil i forberedelsen av standarder, og interferens fra andre forbindelser føre til unøyaktigheter som kan påvirke resultatene betydelig. For å oppnå pålitelige og presise resultater er det derfor nødvendig med grundige forberedelser og en bevissthet om potensielle feilkilder i spektroskopiske målinger.

Hva skjer når lys passerer gjennom forskjellige medier?

Endringen i retningen på en lysstråle avhenger av sammensetningen av mediet den passerer gjennom. Når lys går fra ett medium til et annet, kan retningen på lysstrålen endres, et fenomen kjent som refraksjon. Denne endringen skjer fordi lys har forskjellige hastigheter i forskjellige medier, og den skjer i henhold til forholdet mellom de ulike hastighetene og innfallsvinkelen. Refraksjon vil ikke forekomme dersom innfallsvinkelen er rett vinkel mot grensen mellom mediene.

Forholdene som beskriver dette fenomenet er uttrykt som følger:
$H2 \cdot v1 \cdot \sin(θ1) = n1 \cdot v2 \cdot \sin(θ2)$
Her refererer $n1$ og $n2$ til de respektive refraktive indeksene for de to mediene, $v1$ og $v2$ er hastighetene for lyset i de to mediene, og $θ1$ og $θ2$ er innfallsvinkelen og refraksjonsvinkelen. Dette kan for eksempel skje når lys passerer fra luft (med refraktiv indeks 1,00) inn i vann (med refraktiv indeks 1,33).

Dispensjon oppstår når refraktivindeksen endres med lysbølgens bølgelengde. I vanlig dispresjon øker refraktivindeksen gradvis når bølgelengden reduseres. Dersom frekvensen på den elektromagnetiske strålingen samsvarer med den naturlige vibrasjonsfrekvensen til et molekyl, atom eller ion, vil energien fra strålingen overføres til dette molekylet, atomet eller ionet, noe som fører til et skarpt brudd i sammenhengen mellom refraktiv indeks og bølgelengde. Dette kalles anomal dispresjon.

Refraktive indekser og dispresjonsverdier kan måles med et refraktometer, og disse verdiene brukes både i kvalitativ og kvantitativ identifikasjon. De er også nødvendige for design og evaluering av andre instrumenter for elektromagnetisk stråling.

Når lys passerer gjennom et medium, kan det også bli spredt og reflektert. Når lysstråler treffer partikler suspendert i et medium med en refraktiv indeks forskjellig fra partikkelens, kalles strålingen som spres i retninger andre enn 180° fra den innkommende strålen, for spredning. Hvis bølgelengden til den innkommende strålingen er større enn partikkelstørrelsen, vil strålingen bli fjernet gjennom destruktiv interferens, og lysets vei virker uendret. Hvis bølgelengden blir mindre, eller partikkelstørrelsen øker, kan den spredte lyset bli merkbar.

Nephelometri og turbidimetri er teknikker som utnytter lysets spredning fra kolloidale partikler i suspensjoner. Størrelse, form og konsentrasjon av disse partiklene kan bestemmes ved å analysere lysets spredning. Refleksjon skjer når lysstrålen treffer en grense mellom to medier. Mengden refleksjon avhenger av refraktive indeksforskjellen mellom mediene, og øker når denne forskjellen blir større. Spekulær refleksjon skjer på samme måte som i et speil, der alle bølgelengder reflekteres likt. Diffus refleksjon, derimot, kan innebære at noe av den innkommende lyset blir absorbert eller spredt, noe som gjør at partiklene ser fargede ut. Refleksjonsmålinger brukes i karakterisering av suspensjoner, samt i kvalitetskontroll av stoffer som tekstiler og maling. Både spredning og refleksjon kan anses som potensielle forstyrrelser i absorpsjons- og fluorescensmålinger.

Kompleksiteten i spektrene og intensiteten av spektrallinjene kan bestemmes av flere faktorer. Den første faktoren er antall partikler som befinner seg i de energinivåene som overgangen skjer fra. Den andre faktoren er overgangens sannsynlighet, som kan beskrives av overgangsmonnene. Den tredje faktoren involverer de kvantemekaniske seleksjonsreglene, som angir hvilke overganger som er tillatt eller forbudt. Denne statistiske sannsynligheten kan beregnes og ligger mellom null og en. Svake spektrallinjer har små overgangsmomenter, mens sterke linjer har verdier nær en.

Spektrallinjens bredde påvirker også hvordan spekteret fremstår. Linjer som stammer fra overganger i atomer og molekyler i gassform er karakteristisk smale, mens de som stammer fra elektron- og nukleærspinovergangene har små energiforandringer og derfor er smale. Molekylære absorpsjonsspektra i de infrarøde, synlige og ultrafiolette regionene består av sett med veldig tettliggende linjer som normalt ikke oppløses av instrumenteringen som brukes. Disse linjene blir utvidet gjennom kollisjoner mellom løsemiddel- og løsningstoffmolekyler, slik at det samlede spekteret fremstår som brede overlappende bånd.

Den relative befolkningen av energinivåene, det vil si hvor stor andel av de analyserte partiklene som befinner seg i de ulike nivåene, påvirker intensiteten på spektrallinjene. Dette bestemmes av nivåenes avstand og den termodynamiske temperaturen. For å beregne denne sammenhengen brukes Maxwell-Boltzmann-ligningen:
$\frac{n_1}{n_2} = e^{ -\frac{E}{kT}}$
Her er $n_1$ og $n_2$ antallet partikler i energinivåene $E_1$ og $E_2$, $k$ er Boltzmanns konstant, og $T$ er temperaturen. Ved romtemperatur, og når energiforskjellen mellom nivåene er stor, vil kun det laveste nivået være befolket i betydelig grad. Dette er grunnen til at absorpsjonsspektra i de infrarøde, synlige og ultrafiolette regionene kun stammer fra overganger fra grunntilstanden.

Maxwell-Boltzmann-ligningen viser viktigheten av temperatur og termisk eksitasjon i intensiteten til atomers emisjonsspektra. Derfor er det mulig å ha kontroll over sensitiviteten i atomemisjonsteknikker, men mindre kontroll over molekylære absorpsjonsspektra.