Microchannel plates (MCP's) zijn gevoelige en veelzijdige detectorarrays die veel toepassingen vinden in massaspectrometrie. Ze zijn opgebouwd uit miljoenen glasbuizen, elk met een diameter van ongeveer 6-10 μm en een lengte van 1 mm, die aan de binnenkant zijn gecoat met een halfgeleider. Deze buizen zijn netjes op elkaar gestapeld in een plaat en staan iets gekanteld, vaak met een hoek van ongeveer 8° ten opzichte van de normaal van de plaat. Deze schijnbare complexiteit is een essentieel aspect voor de werking van de MCP.

Wanneer een elektron de plaat binnenkomt, veroorzaakt het een botsing met de wanden van de kanalen. Dit resulteert in de vorming van secundaire elektronen, die op hun beurt verder botsen en nieuwe secundaire elektronen genereren. Dit proces van elektronvermenigvuldiging blijft doorgaan totdat er typisch een versterking van 10^6 is bereikt. Aan de anodezijde van de MCP komt een wolk van duizenden elektronen vrij, die vervolgens als signaalstroom wordt gedetecteerd. De hoge ruimtelijke resolutie die deze detectoren bieden, maakt ze uiterst waardevol voor toepassingen zoals Time-of-Flight (TOF) metingen, omdat ze de TOF-signalen bijna niet verwijden.

MCP's zijn niet alleen geschikt vanwege hun hoge ruimtelijke resolutie, maar ook vanwege hun snelle tijdrespons, die kan variëren van enkele nanoseconden tot minder dan één nanoseconde. Dit maakt ze bijzonder geschikt voor TOF-massaspectrometrie, waar snelheid en precisie essentieel zijn. Doordat alleen een klein aantal kanalen uit miljoenen wordt gebruikt voor de detectie van een specifiek m/z, kunnen verschillende ionen die tegelijkertijd de MCP raken op verschillende plaatsen tegelijkertijd worden gedetecteerd.

In massaspectrometrie komt de verzameling van pieken, die corresponderen met ionen met verschillende massa/charge-verhoudingen (m/z), tot stand na ionisatie, manipulatie van de ionen en massanalyse. De uiteindelijke massaspectra kunnen aanzienlijk variëren afhankelijk van de gebruikte ionisatie-techniek. In het geval van Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI), worden vaak slechts enkele ionen uit een molecule gegenereerd, en deze hebben meestal slechts een of enkele ladingen. Aan de andere kant genereert Electrospray Ionization (ESI) een reeks ionen met meerdere ladingen, wat resulteert in een serie van pieken in het massaspectrum. Dit verschil maakt MALDI-spectra relatief eenvoudig te interpreteren, terwijl ESI-spectra doorgaans complexer zijn.

MALDI-spectra hebben vaak minder pieken, die hoofdzakelijk het enkelvoudig geladen moleculaire ion bevatten, met slechts een klein aantal pieken die twee of drie ladingen dragen. Bij ESI daarentegen is het aantal pieken aanzienlijk groter, omdat elk molecuul in de monsters verschillende ladingen kan dragen, wat leidt tot een reeks van pieken bij verschillende m/z-verhoudingen. Naast moleculaire ionen met meerdere ladingen kunnen ook niet-covalente adducten, zoals natrium- of kaliumionen, matrixionen of fosfaatgroepen, in het spectrum worden waargenomen. Deze adducten kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van de massaverschillen ten opzichte van het oorspronkelijke ion.

Bij ESI-spectra kunnen de pieken worden gedecodeerd door het proces van deconvolutie, waarbij het aantal ladingen voor een reeks pieken wordt geschat en vervolgens het molecuulgewicht wordt berekend. Dit proces vereist nauwkeurigheid, aangezien de juiste lading (n) moet worden bepaald door het verschil in massa tussen de pieken te begrijpen en te corrigeren voor de ladingen. Dit geeft inzicht in het moleculaire gewicht van de gedetecteerde ionen.

De toepassingen van massaspectrometrie (MS) zijn divers en omvatten de identificatie van moleculen, de bepaling van moleculair gewicht en de analyse van isotopenverdelingen. MS biedt extreem nauwkeurige massabepalingen, vaak tot onder de 0,01%, wat betekent dat het mogelijk is om zeer kleine verschillen in massa te detecteren, zoals het onderscheid tussen een gereduceerde en geoxideerde vorm van cysteïnes (2 Da verschil). Dit stelt wetenschappers in staat om zelfs de fijnste variaties in de structuur van biomoleculen te identificeren, zoals het aantal disulfidebindingen in kleine eiwitten.

Massaspectrometrie is ook nuttig voor het identificeren van chemische modificaties, zoals fosforylering of methylatie, en voor het detecteren van post-translationele modificaties in eiwitten. Sommige modificaties, zoals glycosylering, kunnen echter variabel zijn afhankelijk van de bron van het eiwit, waardoor de interpretatie van spectra complexer wordt. In dergelijke gevallen kunnen fragmentatieanalyse en gedetailleerde spectrometrische gegevens nodig zijn om de exacte aard van de modificatie te bepalen.

Isotopenanalyse is een andere krachtige toepassing van MS, waarbij de isotopische samenstelling van moleculen kan worden gemeten. Dit is bijzonder waardevol voor het testen van de integratie van ^13C of ^15N in NMR-monsters en kan helpen bij de bepaling van de exacte moleculaire samenstelling. De analyse van isotopische verdelingen biedt waardevolle informatie over de natuurlijke abundantie van isotopen, zoals ^13C, en stelt wetenschappers in staat om zelfs de kleinste variaties in de isotopische samenstelling van moleculen te detecteren. Dit is van groot belang bij de studie van biomoleculen, zoals eiwitten, waarvan de massa’s sterk kunnen variëren op basis van hun isotopische inhoud.

Bij de analyse van grotere moleculen, zoals eiwitten, kan de hoeveelheid ^13C in een monster leiden tot een reeks van pieken in het massaspectrum, wat de interpretatie verder bemoeilijkt. Dit fenomeen kan echter waardevolle informatie opleveren over de moleculaire opbouw van een stof en de mate van isotopische verrijking.

Het vermogen van massaspectrometrie om moleculen met grote precisie te karakteriseren en te identificeren, samen met de snelheid en gevoeligheid van technieken zoals MCP's, maakt het tot een onmisbare tool in de moleculaire biologie en chemie.

Hoe wordt Isothermische Titraties Calorimetrie (ITC) toegepast in Bindingsexperimenten?

In isothermische titraties calorimetrie (ITC) wordt de hoeveelheid warmte die vrijkomt tijdens de binding van een ligand aan een macromolecuul gemeten om verschillende parameters zoals de dissociatieconstante (Ka) en de verandering in enthalpie (ΔH) te bepalen. De gemeten curve vertegenwoordigt een bindingsisotherm in real time, waarbij de hoeveelheid warmte die vrijkomt tijdens de injectie van het ligand eerst stijgt door de onmiddellijke binding van het ligand. Bij hogere concentraties van het ligand, naarmate de injectie vordert, wordt de verzadiging bereikt. Het vrijkomen van warmte neemt af en keert uiteindelijk terug naar de baseline wanneer het bindingspartner in de cel volledig verzadigd is.

In dit experiment wordt de tijdschaal omgezet naar de ligandconcentratie, en de waarde van Ka kan worden berekend op basis van de bindingscurve met behulp van de relevante vergelijkingen. Het is echter belangrijk om de besparing in experimentele tijd af te wegen tegen de lagere nauwkeurigheid van gegevens bij enkele injecties in vergelijking met meerdere injecties. Het gebruik van de enkele injectiemethode kan minder accuraat zijn, maar biedt een sneller resultaat, vooral bij experimenten waarbij de binding snel plaatsvindt.

Wanneer de complexvorming 100% is bereikt, zal de toevoer van extra injecties geen of slechts kleine warmteveranderingen veroorzaken. Eventuele warmteveranderingen die worden waargenomen na verzadiging kunnen doorgaans worden toegeschreven aan verdunningseffecten. Deze verdunningswarmte ontstaat wanneer de buffers van de bindingspartners niet precies met elkaar overeenstemmen wat betreft concentratie, ionsterkte of pH. Daarom moeten dergelijke verschillen worden vermeden. Het is van cruciaal belang dat de bindingpartners in dezelfde buffer worden geprepareerd om consistentie in de experimentele omstandigheden te waarborgen.

Indien één van de bindingpartners slecht oplosbaar is, moet dit in de cel geplaatst worden, waar een lagere concentratie voldoende is om een betrouwbare meting uit te voeren. Bij kleine molecuulliganden die oplosbaar zijn in organische oplosmiddelen, zoals DMSO, moet ervoor worden gezorgd dat de concentratie van het oplosmiddel in de cel en de injectiespuit gelijk zijn om consistente verdunningswarmten te voorkomen. Het is essentieel om de pH tijdens de verdunning van deze moleculen te controleren, omdat geconcentreerde oplossingen zoals nucleotiden de pH van buffers met een lage buffercapaciteit gemakkelijk kunnen veranderen.

Daarnaast kunnen chemische reacties in de monstercel ook invloed hebben op de gemeten warmte. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van een contaminerende protease kan warmte genereren door hydrolyse van de bindingspartners. De aanwezigheid van instabiele of hydrofobe eiwitten kan ook leiden tot ongewenste effecten, zoals het ontvouwen van eiwitten, wat de signalen in het ITC-experiment kan verstoren. Dit ontvouwen kan leiden tot een soepele verschuiving van de baslijn, wat het moeilijk maakt om de werkelijke ΔH, Ka en stoichiometrie (n) te berekenen.

Om betrouwbare en accurate resultaten te verkrijgen, moeten de concentraties van de bindingspartners goed worden afgestemd. Idealiter zou de concentratie van het bindingspartner in de cel tien keer hoger moeten zijn dan de verwachte dissociatieconstante (Kd), en de concentratie van het molecuul in de spuit moet minstens tien keer groter zijn dan de concentratie in de cel. Dit zorgt ervoor dat de volumeverandering in de cel tijdens de injecties klein blijft, waardoor de berekeningen van ΔH, Ka en n eenvoudiger en nauwkeuriger zijn.

De Wiseman-constante is een aanvullende maatstaf die kan worden gebruikt bij de planning van ITC-experimenten. Deze constante is het product van de associatieconstante Ka en de concentratie van het molecuul in de cel (M0), en het beïnvloedt de vorm van de bindingscurve. Wanneer de Wiseman-constante tussen 100 en 1000 ligt, heeft de bindingscurve een uitgesproken sigmoïdale vorm, wat het mogelijk maakt om de thermodynamische parameters nauwkeurig te bepalen. Bij te steile of te vlakke curves kunnen er grote fouten optreden bij het bepalen van Ka en n.

Bij het meten van hoge affiniteiten, waar de associatieconstante (Ka) zeer groot is, kan de benodigde concentratie van het bindingspartner in de monstercel lager zijn om een goede weergave van de bindingscurve te verkrijgen. Als de signaalintensiteit echter te klein wordt om betrouwbaar te meten, kan een alternatieve methode worden toegepast: het meten van de competitie tussen een zwak gebonden ligand en een hoog-affiniteit ligand. Door een zwak-affiniteit ligand (B) met een bekende Ka toe te voegen aan de cel en dit vervolgens te titreren met het hoog-affiniteit ligand, kan de werkelijke bindingsconstante van het hoog-affiniteit ligand nauwkeuriger worden bepaald.

Bij het meten van enzymkinetiek met ITC wordt vaak gekeken naar de steady-state kinetische parameters zoals kcat en KM voor enzymatische reacties. Dit is mogelijk wanneer de enzymatische reactie gepaard gaat met een waarneembare warmteverandering en langzaam genoeg verloopt om gemeten te worden door het instrument.

Belangrijk om te onthouden is dat de nauwkeurigheid van ITC-afhankelijke experimenten sterk afhankelijk is van de voorbereiding en de controle van experimentomstandigheden. Het zorgvuldig afstemmen van buffers, concentraties en omgevingsomstandigheden kan het verschil maken tussen betrouwbare en vertekende gegevens. Het is essentieel dat de experimenten zorgvuldig worden opgezet en gecontroleerd om de best mogelijke resultaten te verkrijgen.

Wat zijn de belangrijkste toepassingen van polymeer-gebaseerde functionele nanocomposieten in verschillende industrieën?
Hoe werkt Feedback Control op Basis van Gedistribueerde Faseverschuivingsmodulatie in Grote MAC-DPP-systemen?
Hoe de Modern Entertainment-industrie Sociale en Culturele Dynamiek Vormgeeft
Hoe beïnvloedt symbolisch racisme de hedendaagse politiek?