Hoe wordt de levensduur van fluorescerende moleculen gemeten en wat is de betekenis ervan in wetenschappelijke toepassingen?

De meting van de levensduur van fluorescerende moleculen speelt een cruciale rol in diverse wetenschappelijke domeinen, waaronder chemie, fysica en biologie. Het verlangen naar meer precieze levensduurgegevens heeft de ontwikkeling van geavanceerde meetmethoden gestimuleerd. De levensduur van een fluorofore (een molecuul dat fluoresceert wanneer het wordt geëxciteerd) is essentieel voor een nauwkeurige interpretatie van diverse fluorescente metingen zoals quenching, polarisatie en FRET (fluorescentie-energieoverdracht). Deze gegevens worden ook gebruikt in technieken zoals fluorescentiemicroscopie, die in hoofdstuk 7 wordt besproken, en in de bepaling van eiwitfluorescentie in hoofdstuk 12.

De levensduur van een fluorofore is, simpel gezegd, de tijd die het molecuul in zijn geëxciteerde toestand blijft voordat het weer terugvalt naar zijn grondtoestand, waarbij het energie in de vorm van licht uitstraalt. Het begrip "levensduur" is echter complexer dan het lijkt. Hoewel men vaak spreekt over de eigenschappen van fluoroforen in isolatie, worden deze eigenschappen meestal bestudeerd voor populaties van moleculen. De eigenschappen van een typische vertegenwoordiger van de populatie worden afgeleid uit de macroscopische eigenschappen van de groep moleculen. Moderne technieken, zoals het meten van enkel-molecuulfluorescentie, maken het mogelijk om levensduurgegevens van geïsoleerde fluoroforen te verkrijgen door de moleculen duizenden keren te exciteren en een histogram van de fluorescente vervalcurve op te bouwen.

De zoektocht naar de meting van fluorescerende levensduur gaat terug tot de 19e eeuw. George G. Stokes, die in hoofdstuk 1 het begrip "fluorescentie" introduceerde, was zich bewust van de mogelijkheid van een vertraging in de fluoriscerende emissie na de absorptie van licht. Dit idee werd verder onderzocht door wetenschappers zoals Hippolyte Fizeau, die de snelheid van licht onderzocht, en later door E. Becquerel, die in 1859 fosforescentielevensduurmetingen uitvoerde met behulp van een draaiend wiel en pinholesysteem. Een van de eerste serieuze pogingen om fluorescerende levensduur te meten werd ondernomen door R.W. Wood in 1921. Wood gebruikte een stroming van drukvervaarde kleurstoffen die werden geïllumineerd aan de mond van een sproeier. Dit stelde hem in staat om een bovengrens voor de levensduur van fluorescente moleculen vast te stellen, hoewel hij de exacte tijd tussen absorptie en emissie niet kon meten.

In 1926 slaagde Enrique Gaviola er echter in om nauwkeurige levensduurmetingen uit te voeren door het gebruik van een Kerr-cel om de intensiteit van het opwekkingslicht te moduleren. Hij gebruikte de eerste succesvolle frequentiedomeinmeting en bepaalde levensduren van 2 nanoseconden voor rhodamine en 4,5 nanoseconden voor fluoresceïne, die als redelijk nauwkeurige waarden werden beschouwd. Dit leidde tot de opkomst van fluorometers, instrumenten die specifiek zijn ontworpen om de levensduur van fluorescerende moleculen te meten. In de jaren 1920 breidde Francis Perrin het gebruik van polarisatiedata uit, gekoppeld aan zijn theorieën over roterende diffusie, waarmee hij levensduren van verschillende kleurstoffen berekende.

Een ander belangrijke bijdrage aan het meten van levensduur kwam van Gregorio Weber, die in 1969 de levensduur van NADH in oplossing meet. Hij ontdekte een levensduur van 0,38 nanoseconden voor NADH, een waarde die, volgens de polarisatiegegevens van de stof, niet overeenkwam met de eerdere schatting van 4,5 nanoseconden. Weber was van mening dat de polarisatie van een fluorofore een nuttige indicatie kan zijn van de juiste levensduur en benadrukte dat een levensduur van 4,5 nanoseconden zou resulteren in een veel lagere polarisatie, van ongeveer 0,02, terwijl de werkelijke waarde dichter bij 0,15 lag.

De meting van fluorescerende levensduur is dus een cruciaal hulpmiddel geworden voor het begrijpen van de dynamiek van moleculaire interacties en de toestand van fluorescerende stoffen in verschillende omgevingen. De nauwkeurigheid van deze metingen maakt het mogelijk om niet alleen de eigenschappen van de fluoroforen zelf te begrijpen, maar ook om de onderliggende fysische en chemische processen te analyseren, zoals energieoverdracht, quenching en de interacties tussen moleculen.

Er zijn verschillende methoden voor het meten van de levensduur van fluorescerende moleculen, maar de meest gebruikte zijn de impulsmethode en de harmonische responsmethode, die beide dezelfde informatie bevatten, maar in verschillende tijdsdomeinen werken. De tijdsdomeinmeting is de traditionele benadering, waarbij men een excitatiesignaal kort pulseert en de vervalcurve van de fluorescentie meet. Dit biedt een gedetailleerd beeld van hoe snel de moleculen terugkeren naar hun grondtoestand.

De nauwkeurigheid van deze technieken maakt het mogelijk om zelfs kleine variaties in levensduur te detecteren, wat essentieel is in tal van toepassingen, van het meten van eiwitinteracties tot het bestuderen van de eigenschappen van materiaalstoffen in de nanotechnologie. Fluorescentie-levenstijdmetingen zijn ook onmisbaar in biologische toepassingen, zoals het in kaart brengen van de moleculaire omgeving van cellen en het volgen van veranderingen in de structuur en dynamiek van biomoleculen.

Wat is de invloed van quenching op fluorescente eigenschappen?

Quenching verwijst naar het proces waarbij de fluorescentie van een molecuul wordt verminderd, meestal door interactie met een ander molecuul, de zogenaamde quencher. Het quenchingmechanisme kan zowel dynamisch als statisch van aard zijn. In het geval van dynamisch quenching, wordt de fluorescentie verminderd doordat de moleculen van de fluoroforen (de stoffen die licht uitzenden) in hun aangeslagen toestand in botsing komen met de quencher, wat leidt tot een snelle deactivering van de fluoroforen. Dit effect wordt kwantitatief beschreven door de Stern-Volmer-relatie, die een lineaire afhankelijkheid laat zien van de verhouding van de initiële naar de gereduceerde fluorescentie (F₀/F) ten opzichte van de concentratie van de quencher ([Q]).

In een typische Stern-Volmer plot, zoals te zien is voor fluoresceïne gequenched door het jodide-ion (I⁻), kan de quenching constante (Kₛᵥ) worden afgelezen uit de helling van de rechte lijn. Deze constante is een product van de botsingssnelheid (kᵩ) en de levensduur van de aangeslagen toestand in de afwezigheid van de quencher (τ₀), oftewel Kₛᵥ = kᵩτ₀. De quenching snelheid, kᵩ, wordt meestal beschouwd als de diffusie-gebaseerde snelheid, die afhankelijk is van de moleculaire radia van zowel de fluorofor als de quencher, evenals hun diffusiecoëfficiënten.

Hoewel het aannemen van een eenheidswaarde voor de quenching efficiëntie (γ) in veel gevallen redelijk is, hangt de geldigheid van deze benadering af van het specifieke quenchingmechanisme. Sommige quenchers werken via processen zoals elektronenspintoewisseling of elektronentransfer, die complexere dynamieken kunnen veroorzaken. Voor dynamisch quenching geldt de formule:

waarbij τ₀ de levensduur van de aangeslagen fluoroforen in de afwezigheid van de quencher is, en τ de levensduur in de aanwezigheid van de quencher.

Het fenomeen dat de levensduur van fluorescente moleculen wordt verkort door quenching wordt verklaard door het feit dat de fluoroforen die langer in de aangeslagen toestand blijven, meer kans hebben om in botsing te komen met een quencher. Dit leidt tot hun deactivatie, waardoor de gemiddelde levensduur van de fluoroforen afneemt.

Naast dynamisch quenching bestaat er ook statisch quenching, waarbij de fluoroforen een stabiel niet-fluorescerend complex vormen met de quencher in de grondtoestand. Dit wordt weergegeven in de relatie:

waarbij Kₐ de associatieconstante is van het complexe systeem. Statisch quenching heeft geen invloed op de levensduur van de fluoroforen, aangezien het proces plaatsvindt zonder dat de fluoroforen in hun aangeslagen toestand deactiveren. Wanneer zowel dynamisch als statisch quenching aanwezig is, kan de volgende gecombineerde relatie worden afgeleid:

Dit leidt tot een opwaartse kromming in de Stern-Volmer plot, aangezien de quenching zowel de intensiteit als de levensduur van de fluorescente moleculen beïnvloedt.

Bijvoorbeeld, in gevallen van quenching door complexe vorming kan er een verandering in het absorptiespectrum optreden, wat wijst op een verandering in de interactie tussen de fluorofor en de quencher. Een klassiek voorbeeld van statisch quenching werd voor het eerst gerapporteerd door Gregorio Weber in 1948, die geen apparatuur had om fluorescente levensduren te meten, maar gebruik maakte van de relatie tussen polarisatie en levensduur om de aanwezigheid van statisch quenching te identificeren.

Er zijn ook gevallen waarin de Stern-Volmer plots niet lineair zijn, zelfs voor puur dynamisch quenching. Dit kan optreden wanneer niet alle fluoroforen even toegankelijk zijn voor de quencher. Bijvoorbeeld, in proteïnen met meerdere tryptofaanresiduen kan de toegang van de quencher tot deze fluoroforen variëren, afhankelijk van hun locatie binnen de moleculaire structuur. Een voorbeeld hiervan is het quenching van de intrinsieke fluorescentie van LADH (lever-alcoholdehydrogenase) door acrylamide. In dit geval zijn sommige tryptofaanresiduen toegankelijk voor acrylamide, terwijl andere dat niet zijn, wat leidt tot een niet-lineaire Stern-Volmer plot.

In dergelijke systemen kan de gemeten fluorescentie worden geïnterpreteerd als een samengestelde bijdrage van de toegankelijke fluoroforen, en een aangepaste Stern-Volmer vergelijking kan worden afgeleid om deze situatie te modelleren:

waarbij ΔF de geobserveerde verandering in fluorescentie is en fₐ de fractie van toegankelijke fluoroforen. Dit leidt tot een specifieke plot die inzicht biedt in de toegankelijkheid van de fluoroforen voor de quencher.

In de praktijk is het belangrijk te realiseren dat de quenchingprocessen complex kunnen zijn en beïnvloed worden door de specifieke omgeving van de fluoroforen, zoals de oplosmiddelomstandigheden en de interacties tussen de fluoroforen en quenchers. Hoewel veel van de theorieën goed werken voor simpele systemen, kunnen er complicaties optreden in meer complexe biologische of chemische systemen, waar meerdere interacties tegelijkertijd plaatsvinden.

Hoe Fluorescerende Probes de Wetenschap Veranderen: Geschiedenis en Ontwikkeling van Fluorescentie-onderzoek

Het gebruik van fluorescerende probes heeft de biologische en chemische wetenschappen aanzienlijk veranderd. De oorsprong van deze probes gaat terug tot 1871, toen Adolf von Bayer fluoresceïne ontwikkelde, dat later een van de meest gebruikte fluoroforen zou worden. Fluoresceïne is nog steeds populair vanwege de relatief lage kosten, de eenvoud in synthetiseren, en het feit dat het geen patent heeft, wat het toegankelijk maakt voor veel wetenschappers. Deze probe wordt vaak gebruikt in toepassingen waar de chemie van amines of sulfhydryls relevant is. Ondanks de veelzijdigheid van fluoresceïne, heeft het echter een aantal nadelen, zoals fotodegradatie, vooral in de aanwezigheid van zuurstof. Bovendien variëren de spectrale eigenschappen van fluoresceïne afhankelijk van de pH, wat van invloed kan zijn op de resultaten van experimenten, vooral bij polarizatiemetingen.

In 1887 werd rhodamine, een stikstof-analoog van fluoresceïne, geïntroduceerd door Maurice Ceresole. Deze verbinding, een felrode kleurstof, werd uiteindelijk een belangrijke speler in de wereld van fluorescerende probes. Het bleek een waardevolle aanvulling op fluoresceïne, met verschillende varianten zoals rhodamine B en rhodamine 6G. De familie van rhodamine-dyes heeft sindsdien veel aandacht getrokken, vooral vanwege de sterkte van de fluorescentie en de chemische stabiliteit. Rhodamine-dyes zijn in staat om onder verschillende omstandigheden een robuuste fluorescentie te vertonen, en het gebruik van deze probes is in de afgelopen decennia exponentieel toegenomen.

Cyanine-dyes, die in 1856 werden ontwikkeld door Charles Hanson Greville Williams, vormden een andere belangrijke bijdrage aan de ontwikkeling van fluoroforen. In de jaren 1970 werd de chemicus Alan Waggoner bekend door cyanine-dyes te verbeteren voor toepassingen waarbij membraanpotentiaal moest worden gemeten. Dergelijke fluoroforen, zoals Cy3 en Cy5, behoren tot de meest populaire van hun soort. Deze probefamilie werd verder verbeterd door de introductie van Cy3B, die een hogere quantumopbrengst en een langere levensduur vertoonde dan de oorspronkelijke Cy3.

Het gebruik van fluorescerende probes kreeg in de jaren veertig een nieuwe dimensie toen Albert Coons in 1941 voor het eerst fluoresceïne-iso-cyanate gebruikte om antilichamen te labelen. Dit was de geboorte van de immunofluorescentie, een techniek die nog steeds van fundamenteel belang is in celbiologisch onderzoek. In 1958 werd fluoresceïne-iso-thiocyanate (FITC) ontwikkeld om de instabiliteit van de isocyanaat-derivaten te omzeilen. FITC, met zijn twee isomeren, werd de gouden standaard voor fluorofore labeling en blijft tot op heden een van de meest gebruikte fluorescentiemarkers in wetenschappelijk onderzoek.

In de jaren vijftig ontwikkelde Gregorio Weber een methode voor het labelen van eiwitten die geen intrinsieke fluoroforen bevatten, zoals FAD of NADH. Zijn ontwikkeling van dansylchloride, een fluorescerend probe, stelde wetenschappers in staat om de dynamiek van eiwitten en andere biomoleculen in detail te bestuderen. Deze technologische vooruitgang legde de basis voor kwantitatieve biologische fluorescentieanalyse, een gebied dat sindsdien explosief is gegroeid.

De jaren na de introductie van dansylchloride zagen relatief weinig nieuwe fluorescentieprobes, maar er werden enkele belangrijke innovaties gepresenteerd. In 1967, bijvoorbeeld, synthetiseerde Weber pyrenebuterinezuur, een probe met een uitzonderlijk lange levensduur (>100 ns). Deze probe werd gebruikt voor polarisatiemetingen om de hydrodynamica van grote eiwitten te bestuderen, wat een belangrijke stap vooruit was in het begrijpen van de moleculaire structuur van eiwitten in complexe systemen.

Naast de klassieke fluoroforen, zoals fluoresceïne en rhodamine, heeft de voortdurende ontwikkeling van synthetische fluoroforen geleid tot een breed scala aan beschikbare probes. Bedrijven zoals Molecular Probes (nu onderdeel van Thermo Fisher Scientific) en andere bedrijven die zich richten op "designer fluorophores" hebben de beschikbaarheid van fluorescentieprobes wereldwijd enorm vergroot. Dit heeft bijgedragen aan de populariteit van fluorescente technieken in uiteenlopende vakgebieden, van moleculaire biologie tot medische diagnostiek. De overvloed aan beschikbare probes heeft ervoor gezorgd dat wetenschappers niet langer hun eigen fluoroforen hoeven te synthetiseren, wat voorheen vaak een aanzienlijke barrière vormde voor het gebruik van fluorescentie in hun experimenten.

Hoewel de commerciële beschikbaarheid van fluoroforen de toepassing van fluorescentie in de wetenschap heeft vereenvoudigd, betekent dit niet dat onderzoekers zich geen zorgen meer hoeven te maken over de specificiteit en stabiliteit van de probes die zij gebruiken. Het kiezen van het juiste fluoroforelement voor een bepaald experiment is essentieel, vooral wanneer pH-gevoelige probes of probes met kortere levensduur in een reactie betrokken zijn. Er zijn gevallen waarin verschillende probes in combinatie gebruikt moeten worden om de gevoeligheid en resolutie van experimenten te verbeteren.

Het is belangrijk te realiseren dat de keuze van fluoroforen ook invloed heeft op de uiteindelijke interpretatie van de experimenten. Fluorescentie kan worden beïnvloed door externe factoren zoals temperatuur, pH, en de chemische omgeving, wat betekent dat onderzoekers alert moeten zijn op deze variabelen tijdens hun experimenten. Hoewel de technologie achter fluorescerende probes steeds geavanceerder wordt, blijven basisprincipes zoals de stabiliteit van fluoroforen, de kwantumopbrengst en de spectrale eigenschappen cruciaal voor het succesvol gebruik ervan in de wetenschap.