Hoe worden de bewegingen van atomen gemodelleerd in moleculaire dynamica?

De basis van moleculaire dynamica (MD) ligt in het gebruik van de klassieke mechanica om de bewegingen van atomen en moleculen in de tijd te simuleren. De posities van de atomen in een systeem worden bepaald door de oplossing van de Newtoniaanse bewegingsvergelijkingen, waarbij de krachten die op de atomen werken de versnelling bepalen. Dit proces wordt numeriek geïntegreerd, aangezien een analytische oplossing voor de bewegingsvergelijkingen niet mogelijk is. De initiële posities en snelheden van de atomen worden gedefinieerd, waarna de bewegingen van de atomen in opeenvolgende tijdstappen worden berekend.

Om de posities van atomen te berekenen, worden de snelheid en versnelling van elke atoom op elk tijdstip geëvalueerd. De snelheid kan worden vervangen door versnelling in de Newtoniaanse vergelijking en de versnelling kan afgeleid worden van de afgeleide van de energiefunctie. Wanneer de beweging van de atomen wordt gesimuleerd, worden de krachten continu aangepast naarmate de energie van het systeem verandert. De veranderingen in de energie zijn afhankelijk van de configuratie van de atomen en hun interacties met de omliggende omgeving.

De simulatie wordt opgezet door het toewijzen van beginsnelheden aan de atomen, waarbij de temperatuur het kinetische energieprofiel van het systeem bepaalt. De temperatuur regelt het bewegingsgedrag van de atomen, wat leidt tot een oscillatie rond hun evenwichtige posities. Zodra de atomen zich bewegen, wordt het systeem geïsoleerd om de totale energie te behouden, en de atomen evolueren volgens de krachten die op hen werken. Het is essentieel om de atomaire posities te berekenen door middel van de vergelijking van beweging, zodat het systeem zijn dynamische evolutie kan doorlopen.

Voor moleculaire dynamicasimulaties die een realistische interactie tussen een macromolecuul en water vereisen, worden watermoleculen expliciet in het systeem opgenomen. Dit is van cruciaal belang vanwege het sterke dempende effect van water op elektrostatistische interacties, wat een invloed heeft op de totale energie van het systeem. Watermoleculen worden dus modelmatig in een omgeving geplaatst waarin ze interacties ervaren die vergelijkbaar zijn met die in bulkoplosmiddel, wat de nauwkeurigheid van de simulatie ten goede komt. Het alternatief, impliciete oplosmiddelmodellen, zijn minder rekenintensief maar vereisen verregaande benaderingen van de interacties tussen de oplosstof en het macromolecuul.

De integratie van de Newtoniaanse bewegingsvergelijkingen in MD gebeurt numeriek, waarbij het proces wordt verdeeld in kleine tijdstappen. De krachten die op de atomen werken worden berekend, wat resulteert in versnellingswaarden, waarna de snelheid en nieuwe posities van de atomen voor de volgende tijdstap kunnen worden afgeleid. Er zijn verschillende methoden voor de integratie van de bewegingsvergelijkingen, zoals de Verlet-integrator, de leap-frog methode en de velocity Verlet. Deze benaderingen gebruiken verschillende wiskundige technieken, waaronder de benadering van de verplaatsing en snelheid via een Taylor-reeks.

De keuze van de integratiemethode hangt af van de gewenste nauwkeurigheid en de benodigde rekenkracht voor de simulatie. Elke methode heeft zijn eigen voor- en nadelen met betrekking tot de precisie van de resultaten en de efficiëntie van de berekeningen.

In MD-simulaties is het van essentieel belang om niet alleen de kracht- en snelheidsberekeningen zorgvuldig te behandelen, maar ook de stabiliteit van het systeem in de loop van de tijd. De keuze van tijdstappen en integratiealgoritmen kan aanzienlijke invloed hebben op de nauwkeurigheid van de voorspellingen, waardoor de selectie van een juiste methode een belangrijke overweging is voor het succesvol uitvoeren van simulaties.

Hoe EPR en Spin Labels Inzichten Geven in Biomoleculaire Structuur en Dynamiek

In experimenten wordt de spin van een elektron gebruikt als een meetinstrument om gekoppelde kernen te detecteren. Een radiofrequentie-puls veroorzaakt overgangen in de spins van de kernen, en het effect van deze overgangen op de intensiteit van de elektron-spin-resonantie (ESR) wordt gemeten. Het verkregen spectrum komt overeen met een NMR-spectrum van de gekoppelde kernen. Door middel van ENDOR (electron-nuclear double resonance) kunnen de hyperfine koppelingconstante a en de Larmor-frequenties van de gekoppelde kernen worden bepaald. ENDOR maakt het mogelijk om direct waterstofbruggen naar het radicaal te detecteren, en is gebruikt om het waterstofbruggen-netwerk rond het actieve tyrosylradicaal in ribonucleotide-reductase te onderzoeken.

Spinlabels zijn stabiele radicalen, meestal nitroxideradicalen. Een veelgebruikte spinlabel is de thiol-reactieve methanethiol-sulfonaat (MTSSL, Spinlabel voor spinlabel), die disulfidebindingen vormt met cysteïneresiduen in eiwitten. Derivaten van spinlabels, zoals maleïmide- en jodoacetamide-derivaten, zijn ook beschikbaar. Net als bij fluorescentie-labeling kan er gebruik worden gemaakt van alternatieve benaderingen, zoals de incorporatie van spin-gelabelde niet-natuurlijke aminozuren en ligoatie-technieken. Voor nucleïnezuren worden spinlabels direct geïntroduceerd tijdens de solide-fase synthese. Spinlabels kunnen worden gehecht aan de ribose, de fosfaten of de nucleobase. Er zijn verschillende flexibele en stijve spinlabels voor nucleïnezuren beschreven. Voor het bestuderen van membranen zijn er spin-gelabelde lipiden beschikbaar, die een nitroxide-groep bevatten die is gehecht aan hun hydrofobe staart of aan de polaire kopgroep.

Spinvallen zijn bijzonder nuttig voor het meten van de redox-potentiaal van EPR-actieve cofactoren via redox-titraties. Het EPR-signaal van de cofactor wordt gemeten als functie van het gebufferde elektrodepotentieel van de oplossing tijdens titratie met een oxidant of reductant. Het resulterende curve wordt geanalyseerd met de Nernst-vergelijking, wat de redox-potentiaal van de cofactor in verschillende fysiologische omgevingen mogelijk maakt.

De mobiliteit van spinlabels heeft een grote invloed op zowel het g-factor als de hyperfine koppeling. De mate van deze oriëntatie-effecten, en de vorm van het EPR-signaal, hangen af van de mobiliteit van het spinlabel. Een spinlabel informeert zo over de lokale mobiliteit van het molecuul van interesse. Voor zeer mobiele spinlabels worden de oriëntatie-afhankelijke bijdragen volledig gemiddeld, wat leidt tot een nitroxide-signaal met drie scherpe lijnen. Omgekeerd geven immobiele spinlabels die niet bewegen tijdens de transversale relaxatietijd T2 een verbreed rigid-limit-spectrum. Tussen deze extremen worden spectrumvormen waargenomen die een mengvorm van mobiliteit vertonen. Aan de hand van de vorm van het EPR-resonantie kan de roterende correlatietijd van het spinlabel worden bepaald, wat een maat is voor de lokale mobiliteit. EPR kan daarom worden gebruikt om de lokale mobiliteit en dynamiek van biomoleculen in oplossing te monitoren.

De mate van mobiliteit van het spinlabel beïnvloedt altijd de vorm van het gemeten EPR-resonantie, en dit is afhankelijk van de tijdschaal van het experiment, dat wil zeggen, de frequentiebereik dat wordt gebruikt voor excitatie. De algehele tumbling van spin-gelabelde eiwitten is een langzaam proces in vergelijking met de inverse spectrale breedte in hoge frequentie EPR (250 GHz) en draagt niet bij aan de lijnvorm. Bij deze frequenties worden snellere bewegingen zoals de ruggengraatfluctuaties van eiwitten experimenteel toegankelijk en kunnen ze worden bestudeerd.

Door gebruik te maken van multi-frequentie EPR, kunnen onderzoekers verschillende tijdsvensters gebruiken om een breed scala aan moleculaire dynamica en interacties te bestuderen, van langzame bewegingen tot snelle fluctuaties, die allemaal bijdragen aan een beter begrip van de moleculaire functie en structuur. Deze techniek heeft bewezen onmisbaar te zijn bij het bestuderen van complexe biomoleculaire systemen in hun natuurlijke dynamische toestand.

Hoe de verfijning van kristalstructuren de nauwkeurigheid van moleculaire modellen verbetert

In de vroege stadia van het modelbouwproces wordt vaak een gedeeltelijk model van een molecuul gegenereerd, gebaseerd op de eerste elektrondichtheidskaarten die zijn afgeleid uit diffractiegegevens. Dit model is meestal niet volledig en bevat onvolkomenheden. Tijdens de verfijning worden de initiële coördinaten van de atomen aangepast om deze onvolkomenheden te minimaliseren, zodat het model zo goed mogelijk overeenkomt met de experimentele gegevens. Dit iteratieve proces van modelbouw en verfijning wordt herhaald totdat de elektrondichtheidskaarten geen nieuwe kenmerken meer vertonen die in het model moeten worden opgenomen.

Het doel van verfijning is om de atoomcoördinaten en de onzekerheden van de posities (B-waarden) zo te modificeren dat ze de diffractiegegevens zo nauwkeurig mogelijk benaderen. Tegelijkertijd worden de covalente en niet-covalente interacties van de atomen in het model behouden, met een plausibele geometrie. Deze twee aspecten van de verfijning kunnen worden uitgedrukt in een energieformule die een gewogen som is van geometrische en röntgendiffractie-energieën:

$E_{tot} = E_{geometry} + w_{xray} \cdot E_{xray}$

Bij hoge resolutie wordt het belang van geometrische beperkingen verminderd, terwijl de X-ray-energie zwaarder wordt gewogen. Dit wordt vaak bereikt door het verhogen van de parameter $w_{xray}$, waarmee de relatieve bijdrage van de röntgendiffractie-energie wordt verhoogd. Historisch gezien werd de X-ray-energie (E_xray) uitgedrukt als een least-squares-doel, gebaseerd op de vergelijking tussen de waargenomen en berekende structuurfactoren:

Echter, de meest succesvolle benadering in de moderne verfijningstechnieken is de maximale waarschijnlijkheidsmethode (Maximum Likelihood, ML), die de waarschijnlijkheid van het verkrijgen van de meetgegevens (de diffractie) in de context van een moleculair model en de bijbehorende fouten schat. Het idee achter ML is dat de waargenomen structuurfactoren van het model $F_{calc}$ worden geëvalueerd aan de hand van de waarschijnlijkheid dat ze correct zijn, waarbij een foutparameter $\sigma_A$ wordt gebruikt om de mate van betrouwbaarheid van het model te bepalen.

De verfijning van de structuur wordt vaak gemeten met de zogenaamde R-factor, die de resterende verschillen tussen de waargenomen en berekende gegevens kwantificeert. Dit wordt uitgedrukt door de vergelijking:

Aanvankelijk kan de R-factor bij de start van de verfijning rond de 0,5 liggen, maar na verloop van tijd kan deze afnemen tot onder 0,25 voor een goed verfijnde structuur. De R-factor van een macromoleculaire structuur benadert zelden nul vanwege meetfouten in de diffractiegegevens en de suboptimale energieformules die worden gebruikt.

Om te voorkomen dat een verfijning leidt tot overfitting (waarbij het model artificieel beter lijkt dan het in werkelijkheid is), wordt de zogenaamde 'vrije' R-factor (R_free) geïntroduceerd. Dit wordt berekend uit een testset van meer dan 1000 reflecties die niet worden gebruikt tijdens het verfijningsproces. R_free vertegenwoordigt daardoor een betrouwbaardere maat voor de voortgang van de verfijning, aangezien het niet wordt beïnvloed door het model dat in het verfijningsproces wordt gebruikt.

Tijdens het verfijningsproces worden er verschillende technieken toegepast om de nauwkeurigheid van de modelbouw te verbeteren. In de beginfase, wanneer het model waarschijnlijk onvolledig is, wordt vaak gebruik gemaakt van methoden zoals de "rigid-body" verfijning en gesimuleerde annealing. Deze technieken passen grote veranderingen toe op de coördinaten om de domijnen van het molecuul beter af te stemmen op de diffractiegegevens. Gedurende de verfijning wordt het model steeds nauwkeuriger, en worden kleinere aanpassingen aan de atoomcoördinaten en B-waarden uitgevoerd.

Een andere belangrijke overweging tijdens de verfijning is het gebruik van B-waarden om de "onscherpte" van de elektrondichtheid te beschrijven. Deze waarden representeren de thermische vibraties van atomen (dynamische wanorde) en de kleine verschillen in atoomposities tussen kristallografisch identieke moleculen (statische wanorde). De B-waarde is een maat voor de onzekerheid van de positie van een atoom in de ruimte en speelt een cruciale rol in het verfijnen van de nauwkeurigheid van de moleculaire modellen.

De verfijning van de kristalstructuur is dus een complex en iteratief proces, waarbij verschillende technieken en formules worden gebruikt om de nauwkeurigheid van de modelstructuur te verbeteren. Dit proces vereist nauwkeurige afstemming van de coördinaten, de juiste toepassing van geometrische beperkingen en het voortdurend minimaliseren van de verschillen tussen de waargenomen en berekende diffractiegegevens. Het succes van dit proces is van essentieel belang voor het verkrijgen van betrouwbare en gedetailleerde moleculaire modellen, die op hun beurt fundamenteel zijn voor het begrijpen van de eigenschappen van moleculen op atomair niveau.