Deutsch
Francais
Nederlands
Svenska
Norsk
Dansk
Suomi
Espanol
Italiano
Portugues
Magyar
Polski
Cestina
Русский
Při studiu absorpce světla v analytické spektroskopii se setkáváme s několika klíčovými pojmy, které jsou základem pro porozumění měření. Jedním z těchto pojmů je absorpce, což je proces, při němž molekuly látky pohlcují část světelného záření. Absorpce je závislá na třech hlavních faktorech: absorptivitě, délce dráhy světla a koncentraci analyzované látky v roztoku.
Absolutní intenzita záření, které prochází roztokem, je ovlivněna hloubkou roztoku, tedy délkou dráhy, kterou světlo prochází. Tento vztah byl poprvé formulován Lambertem a Bougerem, kteří objevili, že intenzita světla klesá exponenciálně s rostoucí hloubkou roztoku. Tento princip je vyjádřen vzorcem:
kde je absorbance, je počáteční intenzita záření, je intenzita procházejícího záření, je transmitance (poměr procházejícího světla k incidentnímu) a je délka dráhy světla. Tento vztah ukazuje, že absorbance roste lineárně s délkou dráhy, zatímco transmitance klesá exponenciálně.
Podobně jako délka dráhy, koncentrace látky v roztoku má přímý vliv na absorbanci. Vztah mezi koncentrací a absorpcí je opět exponenciální funkcí transmitance, ale lineární funkcí absorbance. Tento vztah je vyjádřen Beerovým zákonem, který popisuje, jak absorbance závisí na koncentraci a absorptivitě látky:
kde je koncentrace absorpční látky, je konstanta pro konkrétní chemický systém a je absorbance. Beerův zákon tedy ukazuje, že absorbance je přímo úměrná koncentraci látky v roztoku.
Absorpce světla je specifická pro každou látku a její vlnovou délku. Protože absorbance závisí na vlnové délce světla, výběr správné vlnové délky je klíčový pro správnou analýzu
Jak funguje fotoакустическая спектроскопия?
Fotoakustická spektroskopie je vysoce citlivá metoda analýzy, která využívá fenomén fotoakustického efektu k získání spekter materiálů. Tento efekt je způsoben absorpcí světelného záření v pevných látkách, kdy výsledné teplo způsobuje fluktuace tlaku v okolním plynu. Tyto tlakové vlny jsou následně detekovány mikrofonem. Na rozdíl od jiných spektroskopických metod, kde mohou odražené nebo rozptýlené záření ovlivnit výsledky, fotoakustická spektroskopie umožňuje přesné měření pouze v případě, že záření je absorbováno vzorkem, čímž se minimalizuje rušení způsobené jinými formami záření.
Významným rysem této techniky je, že i malá změna v absorpci světla může vést k detekci velmi jemných signálů. To činí tuto metodu ideální pro analýzu materiálů, kde by konvenční spektroskopie nemusela poskytovat dostatečně přesné výsledky, jako je tomu u vzorků s vysokým rozptylem světla nebo u biologických materiálů, jako je krev.
Fotoakustická spektroskopie je obzvláště užitečná pro studium pevné hmoty a pro aplikace, kde je potřeba rychlé a přesné identifikování složek bez nutnosti jejich předchozí separace. Například studie krve, kde konvenční spektroskopie neumožňuje dostatečně jasnou analýzu kvůli silnému rozptylu světla, fotoakustická metoda poskytuje čisté a přesné spektrum, které umožňuje detailní zkoumání jak celkového vzorku, tak i jednotlivých komponent, jako jsou červené krvinky a hemoglobin.
V praxi může být fotoakustická spektroskopie implementována pomocí jednopaprskových nebo dvoupaprskových zařízení. V jednopaprskovém zařízení je světelný signál ze zdroje záření nejprve digitalizován, aby bylo možné eliminovat případné odchylky ve spektru způsobené výkyvy v intenzitě lampy. U dvoupaprskového zařízení se používá dvě různá měření: jedno pro vzorek a druhé pro referenční materiál, což pomáhá kompenzovat změny v intenzitě světla a zlepšuje přesnost měření.
Fotoakustická spektroskopie má široké spektrum aplikací. Například v oblasti organických sloučenin umožňuje rychlou identifikaci separovaných látek na tenkovrstvých chromatografech. Spektra získaná z chromatografických desek lze porovnat s těmi, které pocházejí z roztoků stejné sloučeniny, což usnadňuje jejich identifikaci. Tato metoda je také užitečná při zkoumání povrchů, materiálů, polovodičů nebo biologických vzorků, jako jsou živočišné tkáně nebo mořské řasy.
V oblasti analýzy poloměrů a malých vzorků se fotoakustická spektroskopie osvědčuje jako velmi efektivní nástroj, zejména při analýze vzorků v infračervené oblasti spektra, kde poskytuje kvalitní výsledky při použití Fourierovy transformace pro zajištění potřebného poměru signál/šum. Tento postup je nezbytný pro kvalitní identifikaci složek pevných látek, jako jsou například katalytické povrchy.
Fotoakustická spektroskopie je tedy velmi cennou metodou pro analýzu materiálů, která dokáže přinést rychlé a přesné výsledky i v těch případech, kde jiné techniky mohou selhávat, zejména u materiálů s vysokým rozptylem světla nebo komplexních biologických vzorcích.
Jak funguje chemiluminiscenční spektroskopie?
Chemiluminiscenční spektroskopie (CL) je analytická technika, která využívá emisi světla vznikající při chemických reakcích, kde dojde k uvolnění energie ve formě viditelného fotonu. Tato reakce je charakterizována vznikem excited species, které následně vyzařují světlo. Tento jev je často využíván pro detekci a kvantifikaci různých analytů díky své vysoké citlivosti a absenci externího světelného zdroje, což eliminuje šum a rozptyl světla typický pro fluorescenční metody.
Základní požadavky pro měření pomocí CL jsou jednoduché. Stačí smíchat reaktanty a změřit vyzařované světlo. Na rozdíl od fluorescenčních metod, které vyžadují externí světelný zdroj, se CL měření vyznačuje absencí fluktuací zdroje a rozptylu, což může vést k nižším detekčním limitům. V CL měřeních však existuje určitý chemický šum a pozadí, které mohou ovlivnit citlivost detekce, a proto je důležité používat reagensy a rozpouštědla nejvyšší čistoty.
Chemiluminiscenční reakce jsou široce známé a zahrnují celou řadu různých chemických systémů. Mezi nejvýznamnější patří reakce v plynném fázi, kde je klíčovou složkou ozon. Reakce ozonu s různými organickými látkami vedou k tvorbě excited species, které následně vyzařují světlo v různých vlnových délkách. Například reakce ozonu s olefiny vede k emisi světla v rozsahu 300 až 600 nm, zatímco reakce s oxidem dusíku nebo síry uvolňují světlo při jiných vlnových délkách.
V roztoku jsou pro CL reakce velmi užitečné látky, jako je luminol, akridinium estery, aryl oxaláty, dioxetany a metalo-komplexní sloučeniny, jako je tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(III). Luminol je jedním z nejběžněji používaných reaktantů v chemiluminiscenčních reakcích, jehož emise světla je v modré oblasti spektra, přibližně při 425 nm. Reakce luminolu obvykle zahrnují oxidanty, jako je peroxid vodíku, přičemž k reakci je zapotřebí katalyzátoru, typicky přechodných kovových iontů, jako je Co2+, Cu2+ nebo Fe3+.
Akridinium esterové reakce jsou podobné těm, které používají luminol, ale v tomto případě není potřeba žádného katalyzátoru. Oxidace pomocí alkalického peroxidu vodíku vede k tvorbě excited species, které následně vyzařují světlo. Emise je zpravidla v oblasti 440 nm. Vysokou účinností se vyznačují i reakce peroxyoxalátů, kde se jako fluorofor používají látky, které přenášejí energii na excited species, což vede k vyzařování světla.
Dioxetany jsou další skupinou sloučenin, které se používají v CL reakcích. Jedná se o cyklické peroxidy, které mohou být stabilní při pokojové teplotě, ale lze je chemicky aktivovat k produkci chemiluminiscence. Tyto sloučeniny obvykle obsahují ochrannou skupinu, která je uvolněna za přítomnosti enzymů, jako je alkalická fosfatáza. Po odstranění ochranné skupiny dochází k dekompozici, která vede k emisí světla.
V systému s rutheniovým komplexem Ru(bpy)32+ je emise světla vyvolána přechodem z excited stavu tohoto komplexu. K excitaci dochází elektronovým přenosem, přičemž regenerace komplexu je dosaženo po emisi světla. Tento systém je jedním z nejběžněji používaných pro chemiluminiscenční analýzu, kde je intenzita emisního světla přímo úměrná koncentraci reaktantů.
Všechny tyto reakce lze využít pro kvantitativní analýzu, přičemž intenzita vyzařovaného světla je závislá na koncentraci analyzované látky. V některých případech je měření intenzity světla prováděno v závislosti na čase, přičemž dynamika chemiluminiscenční reakce může poskytnout cenné informace o koncentraci analyzovaného analytu.
Pro měření chemiluminiscence existují dva základní přístupy: statické vzorky a tekoucí proudy. Při použití statického vzorku jsou reaktanty smíchány a intenzita světla je měřena v průběhu reakce, což může zahrnovat maximální intenzitu, integrovanou intenzitu nebo jiný parametr, jako je šířka vrcholu nebo rychlost poklesu intenzity. Tento způsob se běžně používá například pro imunologické testy nebo analýzu nukleových kyselin.
Při použití tekoucích proudů jsou reaktanty neustále míchány a světelný signál je detekován na pevném místě, což je často používaný přístup v průmyslových aplikacích chemiluminiscenční spektroskopie.
Chemiluminiscenční spektroskopie má široké využití, ale je třeba si uvědomit, že vyžaduje velmi čisté reaktanty a pečlivou kontrolu podmínek reakce. Chemická reakce je často krátkodobá, a proto je důležité rychle reagovat na signály, které mohou nastat pouze v určitém časovém okně. Důkladná příprava a optimalizace experimentu jsou nezbytné pro dosažení přesných a opakovatelných výsledků.