Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве

, ,

ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, Москва, Россия

Вакцинопрофилактика является основным средством борьбы с инфекционными заболеваниями. Однако, несмотря на успехи проводимой в течение почти 50 лет массовой иммунизации детского населения, коклюш остается серьезной проблемой для здравоохранения – сохраняются эпидемиологические особенности этой инфекции (периодичность подъемов и спадов заболеваемости, сезонность, очаговость); регистрируются летальные случаи и заболеваемость среди привитых лиц; наметились структурные изменения в возрастной заболеваемости коклюшем - наряду с сохраняющейся высокой заболеваемостью детей до 1 года, отмечается увеличение заболеваемости в старших возрастных группах детского населения. Указанные выше факты свидетельствуют о неблагоприятной эпидемиологической обстановке по коклюшу и широкой циркуляции возбудителя среди населения. Одной из причин такого развития эпидпроцесса коклюшной инфекции может явиться изменчивость возбудителя коклюша.

В настоящем исследовании представлены результаты изучения динамики изменчивости четырех основных генов патогенности – ptxА, prn, fim2 и fim3 штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем.

Результаты и обсуждение

Изучено 185 штаммов B. pertussis, выделенных в г. Москве, в том числе 95 штаммов выделенных в г. г., а также 90 штаммов B. pertussis, выделенных в г. г. (из коллекции ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора»), три вакцинных штамма, используемых в настоящее время для производства АКДС-вакцины в нашей стране, полученные из НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. .

Для удобства обсуждения полученных результатов было выделено три периода наблюдения, характеризующиеся различным течением эпидпроцесса. Первый (I) период наблюдения включал допрививочный период (г. г.), когда показатели заболеваемости коклюшем на 100000 населения (ПЗ) достигали высоких значений - 574,0, и первые 10 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной с резкими подъемами и спадами заболеваемости. Второй (II) период наблюдения – через 20 лет проведения массовой иммунизации (г. г.); в начале которого отмечалась относительная стабилизация уровня заболеваемости и медленное снижение заболеваемости (в 70-е годы) с сохранением периодических подъемов; однако, в это время началось сокращение охвата детей прививками, что в последующие годы вызвало подъем заболеваемости. Поэтому уже в 80-е годы регистрировались резкие подъемы заболеваемости. Чтобы проследить за изменчивостью ptxА и prn генов штаммы B. pertussis II периода наблюдения были разделены на две группы по годам (г. г. и г. г.). Третий (III) период наблюдения ( г. г.), в котором периодические подъемы и спады заболеваемости коклюшем происходят на фоне достаточно высокого охвата прививками АКДС-вакциной детей в возрасте от 6 до 12 месяцев.

Определение серотиповой принадлежности с многофакторными сыворотками показало, что из 33 штаммов B. pertussis I периода наблюдения большинство,7%) штаммов принадлежали к серотипу 1.2.3. Данный серотип доминировал среди штаммов B. pertussis, циркулировавших в период, предшествующий массовой иммунизации детей АКДС-вакциной, и характеризовался высокой вирулентностью. Другое распространение серотипов отмечали во II периоде наблюдения - из 57 штаммов B. pertussis,,4%) штаммов принадлежали к серотипу 1.0.3, который явился доминирующим в популяции штаммов B. pertussis, начиная с середины 60-х годов; 9 (15,8%) штаммов – к серотипу 1.2.3 и 1 (1,8%) штамм – к серотипу 1.2.0. Среди штаммов B. pertussis, выделенных в 1990 – 2005 гг. (III период наблюдения),,5%) штаммов принадлежали к серотипу 1.0.3, 8 (8,4%) штаммов - к серотипу 1.2.3 и 2 (2,1%) штамма – к серотипу 1.2.0.

Среди изученных штаммов B. pertussis при секвенировании выявлено три варианта последовательности, которые соответствовали трем аллелям этого гена: ptxA1 (AJ245366), ptxA2 (AJ245367) и ptxA4 (AJ245368) и различались по наличию мутаций в двух областях гена - 193п. нп. н. и 676п. н.- 699 п. н. Последовательности нуклеотидов, характерные для ptxA2 и ptxА4 аллелей, различались между собой в положениях 204 - А (ptxА4) и С (ptxA2) и в положениях 694 и 696 - G (ptxА4) и А (ptxA2); G (ptxА4) и А (ptxA2), соответственно. Эти аллели были обозначены как «вакцинные». Для аллеля ptxА1 – наличие нуклеотида С в положении 204 (также как и у ptxА4), и мутация в положении 684 замена G на А (замена аминокислоты метионина на изолейцин), которая не встречалась ни у одного из описанных ранее аллелей ptxА гена (данный аллель обозначен, как «невакцинный»).

Для штаммов B. pertussis I периода наблюдения, также как и для производственных штаммов, характерным было наличие «вакцинных» аллелей гена коклюшного токсина - ptxА2 или ptxА4 аллелей (рис. 1). Из них%) штаммов имели ptxА2 аллель и%) штаммов – ptxА4 аллель. С начала 70-х годов в популяции штаммов коклюшного микроба появились штаммы с новым «невакцинным» аллелем этого гена – ptxА1 аллелем. Так, среди 30 изученных штаммов B. pertussis, выделенных в 70-е годы,,3%) штаммов имели ptxА4 аллель гена, 9 (30%) штаммов – ptxА2 аллель и 5 (16,7%) штаммов – ptxА1 аллель гена, последние штаммы выделены в начале 70-х годов. Таким образом, начиная с 80-х годов штаммы, имеющие «невакцинный» ptxА1 аллель гена, стали доминирующими в популяции и полностью вытеснили штаммы с «вакцинными» аллелями.

Было показано, что у штаммов B. pertussis наиболее распространены prn1 («вакцинный» аллель), prn2 или prn3 («невакцинные») аллели гена. Остальные аллели prn гена встречались довольно редко. Наиболее существенные изменения в последовательности нуклеотидов между «вакцинным» prn1 аллелем и «невакцинными» prn2 или prn3 аллелями гена отмечены в положении 832-834 - замена триплета GCG (prn1) на TTC (prn2 или prn3), что соответственно сопровождается заменой аминокислоты аланина на фенилаланин; и в положении 836 – T (prn1) на G (prn2 или prn3) с заменой валина на глутамин, кроме того, у штаммов с prn2 аллелем имеется дополнительный фрагмент в 15 п. н., который отличает данный аллель от prn3 аллеля.

Так, для всех 33 штаммов B. pertussis I периода наблюдения характерным было наличие prn1 аллеля (рис. 1). Среди 30 штаммов B. pertussis, выделенных в 70-е годы,%) штаммов имели prn1 и 3 (10%) штамма – prn3 аллели гена. Последний аллель (prn3) является «невакцинным» аллелем этого гена и впервые был выделен у штаммов B. pertussis в начале 70-х годов. Эти штаммы также характеризовались и новой структурой ptxА гена – ptxА1 аллелем, что отличало структуру генов этих штаммов от структуры генов большинства штаммов I периода наблюдения. В последующем доля таких штаммов увеличилась до 25,1% в 80-е и 90-е годы. Вместе с тем, уже к концу 80-х годов появились штаммы с другим «невакцинным» аллелем prn гена (prn2). Среди 34 штаммов B. pertussis, выделенных в 1980-99г. г.,,7%) штамм имели prn1, 5 (14,7%) штаммов – prn2 и 8 (23,6%) штаммов – prn3 аллели гена. Из 88 штаммов B. pertussis, выделенных в г. г.,%) штаммов имели prn2,,7%) штаммов – prn3 и 2 (2,3%) штамма – prn1 аллели гена. Структура prn гена вакцинных штаммов соответствовала структуре штаммов B. pertussis, циркулировавших в допрививочный период, то есть «вакцинному» аллелю этого гена - prn1 аллелю. Таким образом, в последние годы циркулирующая популяции штаммов возбудителя коклюша представлена штаммами с «невакцинными» аллелями prn гена - prn2 и prn3, однако, единичные штаммы с «вакцинным» аллелем этого гена еще встречаются. Следовательно, изменения в генетической структуре гена пертактина (prn) идут медленнее, чем в гене коклюшного токсина (ptxA), но уже к настоящему времени два «невакцинных» аллеля - prn2 и prn3 заняли доминирующее положение в популяции.

Среди изученных штаммов B. pertussis при секвенировании фимбриальных (fim2 и fim3) генов выявлено два варианта последовательности нуклеотидов для fim2 гена и два варианта для fim3 гена, которые соответствовали четырем аллелям: fim2-1(Y00527), fim2-2(AJ420988), fim3A (X51543) и fim3B(AY464180). Для fim2 гена последовательности нуклеотидов различались в положении 521 - G (fim2-1) и А (fim2-2) (замена аргинина на лизин); и для fim3 гена - в положении 595 - С (fim3A) и А (fim3В) с заменой аланина на глутамин.

Показано, что адаптация штаммов B. pertussis по фимбриальным генам также проходила по пути появления новых «невакцинных» аллелей fim2 и fim3 генов - fim2-2 и fim3-В, которые замещали старые «вакцинные» аллели - fim2-1 и fim3-А (рис. 2). Из 19 штаммов B. pertussis I периода наблюдения, 17 штаммов (89,5%) имели «вакцинный» аллель fim2 гена - fim2-1 и 2 (10,5%) штамма «невацинный» аллель - fim2-2. Среди 15 штаммов, выделенных в 70-80-е годы (II период наблюдения), 8 (53,3%) штаммов имели fim2-1 и 7 (46,7%) штаммов fim2-2 аллели. Среди штаммов, выделенных в последние 16 лет (III период наблюдения),%) штамма характеризовались наличием у них «невакцинного» fim2-2 аллеля и 8 (25%) штаммов имели старый «вакцинный» fim2-1 аллель. При изучении структуры другого фимбриального гена (fim3) также были показаны штаммовые вариации (рис. 2). У всех 19 штаммов I периода наблюдения был выявлен «вакцинный» fim3А аллель. Среди 15 штаммов II периода наблюдения 8 (53,3%) штаммов имели «вакцинный» fim3А аллель и 7 (46,7%) штаммов имели новый «невакцинный» fim3В аллель. Для,5%) штаммов III периода наблюдения характерным было наличие fim3В аллеля и для 4(12,5%) штаммов – fim3А аллеля.

Анализ сопоставления аллельных вариаций четырех основных генов - ptxА, prn, fim2 и fim3 показал, что адаптация возбудителя коклюша, по-видимому, шла по пути изменений сначала в ptxА гене, затем в prn гене и фимбриальных генах. Так, все появившиеся штаммы, имевшие «невакцинные» аллели prn гена (prn3) и фимбриальных генов (fim2-2 и fim3-В) имели уже «невакцинный» аллель ptxА гена (ptxА1), т. е. сначала среди штаммов prn1 аллеля появились штаммы с новым измененным аллелем ptxА гена, который в последующем устойчиво утвердился и занял доминирующее положение в популяции штаммов возбудителя коклюша. Далее, мы полагаем, изменения затронули prn ген, с появлением штаммов с «невакцинным» prn3 аллелем, и фимбриальные гены. Так, если в начале 70-х годов в популяции штаммов доминировали штаммы с «вакцинными» prn1, fim2-1 и fim3А аллелями, то к концу 70-х и в 80-е годы появились штаммы prn3 аллеля, которые имели сочетания «вакцинных» и «невакцинных» аллелей фимбриальных генов (fim2-1; fim3В и fim2-2; fim3А), наряду с сохранением в популяции штаммов «вакцинных» аллелей фимбриальных генов (fim2-1; fim3А) и появлением штаммов со всеми измененными аллелями (ptxА1, prn3, fim2-2 и fim3В). С середины 80-х годов в популяции стали регистрироваться штаммы с «невакцинным» аллелем prn2, которые имели «невакцинные» аллели фимбриальных генов. Следовательно, начиная с 90-х годов, в популяции стали доминировать штаммы «невакцинных» аллелей четырех генов - ptxА1, prn2, fim2-2, fim3В и ptxА1, prn3, fim2-2 и fim3В.

Таким образом, данное исследование показало, что возбудитель коклюша подвержен микроэволюционным изменениям, которые затрагивают основные факторы патогенности, играющие ведущую роль в запуске инфекционного процесса и развитии патогенеза заболевания. Формирование популяции с измененной структурой происходило постепенно, наиболее существенные мутационные процессы отмечаются в гене коклюшного токсина, пертактина и фимбриальном fim3, приводящие к замене аминокислот в молекулах белков, что является адаптационным фактором, способствующим распространению штаммов в меняющихся условиях существования.

Выводы:

Рис1. Доля штаммов B. pertussis с аллельными вариациями генов коклюшного токсина (ptxA) и пертактина (prn)

ptxA

prn

Рис.2 Доля штаммов B. pertussis с аллельными вариациями фимбриальных генов (fim2 и fim3)

fim2

fim3