Fotoakustyczna cytometria przepływowa (PAFC) jest innowacyjną metodą, która pozwala na wykrywanie małych cząsteczek w ruchu, które wykazują pewną absorpcję optyczną. W kontekście badań mikrobiologicznych, umożliwia ona identyfikację i liczenie bakterii w próbkach płynnych, wykorzystując zjawisko fotoakustyczne – kombinację światła i dźwięku do uzyskania cennych informacji o strukturze próbek. Główne zastosowanie tej technologii polega na detekcji bakterii opartych na ich interakcji z odpowiednio oznakowanymi fagami bakteryjnymi, które indukują absorpcję optyczną.

Do wykonania eksperymentów PAFC wykorzystywane są hodowle komórkowe bakterii, które są znakowane odpowiednimi fagami bakteryjnymi. Zgodnie z opisanym protokołem, bakterie można wprowadzać do próbki, a następnie monitorować ich interakcję z falą świetlną przy użyciu systemu fotoakustycznego. Sam proces przygotowania próbek oraz przeprowadzanie eksperymentu są skomplikowane i wymagają staranności w manipulacji materiałem biologicznym.

Aby rozpocząć eksperyment, należy najpierw przygotować hodowlę bakterii. W tym celu używa się klasycznej metody aseptycznego transferu próbek z zamrożonych szczepów bakteryjnych na odpowiednie pożywki. Po kilkunastu godzinach inkubacji w temperaturze 37°C, bakterie są przenoszone do pożywek płynnych i intensywnie mieszane przez następne 16 godzin w kąpieli wodnej. Kolejnym krokiem jest rozcieńczenie hodowli bakteryjnej do żądanej koncentracji i jej połączenie z próbkami krwi lub roztworem buforowym (PBS) w celu przygotowania próbki do testów.

Przygotowanie odpowiedniego środowiska dla fagów bakteryjnych jest równie istotnym krokiem. Fagi, które mają zostać użyte w eksperymencie, powinny być najpierw rozmrożone i poddane reakcji z barwnikiem, takim jak Direct Red 81, co umożliwia ich późniejsze wykrycie za pomocą światła lasera o długości fali 532 nm. W celu usunięcia nadmiaru barwnika, fagi są następnie oczyszczane i ponownie zawieszane w buforze, co zapewnia wysoką jakość przygotowanych próbek do analizy.

Kolejnym etapem jest przygotowanie mikrosfer i wiązanie ich z ogonami fagów bakteryjnych. W tym celu stosuje się technologię oczyszczania gradientem CsCl, co pozwala na usunięcie niechcianych części wirusów i pozostawienie tylko ogonów fagowych. Proces ten, choć skomplikowany, zapewnia wysoką czystość próbek, co jest kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników w eksperymencie.

Fotoakustyczny system cytometrii przepływowej składa się z lasera Nd:YAG, który generuje światło o długości fali 532 nm, oraz odpowiednich detektorów akustycznych, które umożliwiają rejestrację generowanych fal dźwiękowych. Próbki płynne, zawierające bakterie i ich fagi, przepływają przez specjalnie zaprojektowaną komorę, w której promieniowanie laserowe jest przekierowywane na analizowaną próbkę. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie precyzyjnych danych na temat obecności i liczby bakterii w próbce.

Za pomocą tego systemu, możliwe jest przeprowadzanie testów na próbce, takiej jak krew ludzka, w celu identyfikacji obecnych bakterii. Ważnym elementem jest zastosowanie dwufazowego przepływu, w którym jedna faza to próbka biologiczna, a druga to olej mineralny. Ten rodzaj przepływu pozwala na uniknięcie problemów związanych z zablokowaniem próbki w rurkach, zapewniając równocześnie optymalną analizę. Sygnaly są wzmacniane za pomocą wzmacniacza, a następnie analizowane przez odpowiednie oprogramowanie komputerowe, które wykonuje obliczenia na podstawie zebranego materiału.

Dzięki tej technologii, możliwe jest szybkie i precyzyjne wykrywanie bakterii, co ma kluczowe znaczenie w diagnostyce mikrobiologicznej, szczególnie w kontekście identyfikacji infekcji bakteryjnych u ludzi. Zastosowanie fotoakustycznej cytometrii przepływowej w diagnostyce pozwala nie tylko na szybsze wykrywanie patogenów, ale również na bardziej dokładne określenie ich liczby, co jest nieocenioną pomocą w terapii.

Nie należy jednak zapominać, że sama technologia, mimo swojej skuteczności, wymaga bardzo precyzyjnego przygotowania próbek, dbałości o czystość materiałów oraz odpowiedniego ustawienia sprzętu, by uniknąć błędów w pomiarach. Każdy etap, od hodowli bakterii, przez przygotowanie fagów i mikrosfer, po przeprowadzanie eksperymentu, wymaga szczególnej uwagi.

Jak głębokie uczenie rewolucjonizuje wirtualne barwienie histologiczne w obrazowaniu UV-PAM?

W obrazowaniu fototermoakustycznym opartym na promieniowaniu ultrafioletowym (UV-PAM) zastosowanie światła o długości fali 266 nm pozwala uzyskać wysoki kontrast jądrowy bez potrzeby stosowania znaczników chemicznych. Ta właściwość wynika z silnej absorpcji promieniowania UV przez kwasy nukleinowe (DNA/RNA), co generuje silny sygnał fototermoakustyczny. Dzięki temu UV-PAM umożliwia tworzenie obrazów zbliżonych do tych, które uzyskuje się w klasycznej histopatologii po barwieniu hematoksyliną i eozyną (H&E), bez potrzeby fizycznego barwienia próbek.

Mimo wysokiej rozdzielczości strukturalnej i kontrastu jądrowego, obrazy UV-PAM są zazwyczaj prezentowane w skali szarości. Dla patologów przyzwyczajonych do interpretacji obrazów barwionych H&E, kolor odgrywa kluczową rolę w analizie zarówno struktur komórkowych, jak i ich otoczenia. Aby zwiększyć kliniczną użyteczność UV-PAM, konieczne było opracowanie metod umożliwiających cyfrowe przekształcenie obrazów czarno-białych w kolorowe, przypominające konwencjonalne preparaty histologiczne.

Pierwszym podejściem była ręczna koloryzacja obrazów na podstawie mapowania amplitudy sygnału PA na wybrany model kolorów odpowiadający schematowi H&E. Metoda ta, choć skuteczna wizualnie, wymagała szczegółowej wiedzy na temat właściwości optycznych tkanek i żmudnego dopasowania parametrów w zależności od zmienności biologicznej. Próbowano również wykorzystać oświetlenie wielofalowe, a następnie przetwarzać obrazy przy użyciu algorytmów segmentacji jąder komórkowych i ważonego łączenia informacji uzyskanych z różnych długości fal. Efekt końcowy przypominał klasyczne obrazy H&E, jednak cały proces pozostawał zależny od interwencji eksperta i wcześniejszej wiedzy na temat próbki.

Zupełnie inny paradygmat oferuje głębokie uczenie – podejście wysoce nieliniowe, niewymagające wcześniejszego modelowania procesów fizycznych czy optycznych. W kontekście UV-PAM, głębokie sieci neuronowe uczą się odwzorowania pomiędzy obrazami bez znaczników a odpowiadającymi im barwionymi chemicznie preparatami histologicznymi. Dzięki temu możliwe jest wirtualne barwienie tkanek, które oddaje nie tylko jądra komórkowe, ale również złożoną morfologię otaczających struktur.

Jednym z najefektywniejszych podejść w tej dziedzinie są generatywne sieci przeciwstawne (GAN). Składają się one z dwóch komponentów – generatora, który tworzy sztuczne obrazy przypominające rzeczywiste dane, oraz dyskryminatora, którego zadaniem jest odróżnienie obrazów syntetycznych od prawdziwych. Te dwa moduły uczą się w układzie konkurencyjnym, stopniowo poprawiając jakość generowanych obrazów. W trakcie treningu sieć optymalizuje funkcję celu zawierającą różne funkcje straty – zarówno mierzące różnice pomiędzy obrazami wygenerowanymi a rzeczywistymi, jak i skuteczność klasyfikacji przez

Jakie wyzwania wiążą się z poprawą jakości obrazu w tomografii fotoakustycznej?

W ostatnich latach, technologia tomografii fotoakustycznej zyskała na znaczeniu, oferując wyjątkowe możliwości w zakresie obrazowania tkanek biologicznych. Jednym z kluczowych wyzwań, z którymi borykają się badania nad tomografią fotoakustyczną, jest poprawa jakości uzyskiwanych obrazów, zwłaszcza w kontekście ograniczonej liczby danych oraz pasma sygnału. Współczesne algorytmy rekonstrukcji obrazu, oparte na metodach głębokiego uczenia, stają się kluczowe w rozwiązywaniu tych problemów, pozwalając na uzyskanie lepszej rozdzielczości obrazu, a także na efektywniejsze wykorzystanie dostępnych danych.

W tradycyjnych systemach tomografii fotoakustycznej często brakuje wystarczającej liczby próbek, co prowadzi do tzw. problemu ograniczonych danych. Z tego powodu obrazowanie w tomografii fotoakustycznej jest często obarczone dużymi zniekształceniami. Nowe algorytmy rekonstrukcji, takie jak te oparte na sieciach neuronowych, starają się rozwiązać te trudności, stosując zaawansowane metody interpolacji i poprawy jakości obrazu. Jednym z przykładów jest algorytm Res-Unet, który wykorzystuje sieci typu Unet do rekonstrukcji obrazu na podstawie ograniczonego zbioru danych, znacząco poprawiając rozdzielczość i wierność obrazów fotoakustycznych.

Zastosowanie głębokiego uczenia w tomografii fotoakustycznej staje się również odpowiedzią na problem wąskiego pasma sygnału. W praktyce, w klasycznych systemach fotoakustycznych, pasmo sygnału jest ograniczone, co prowadzi do utraty cennych informacji o strukturze tkanek. Dzięki algorytmom wspomaganym przez sztuczną inteligencję możliwe staje się rozszerzenie tego pasma, co znacząco poprawia jakość finalnych obrazów. Metody te, takie jak głębokie sieci neuronowe, pozwalają na odzyskiwanie szczegółów, które w przeciwnym razie zostałyby utracone, umożliwiając tym samym uzyskanie bardziej dokładnych i diagnostycznie użytecznych wyników.

Kolejnym ważnym elementem jest integracja różnych źródeł danych. Nowoczesne systemy fotoakustyczne łączą różne techniki obrazowania, takie jak ultrasonografia i tomografia optoakustyczna. Taki system multimodalny pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości i doskonałej jakości, dzięki połączeniu informacji z różnych źródeł. Jednakże wyzwaniem pozostaje synchronizacja tych źródeł oraz odpowiednia kalibracja urządzeń, co niejednokrotnie wymaga zaawansowanej obróbki sygnałów.

W przypadku praktycznego zastosowania tomografii fotoakustycznej w medycynie, niezwykle istotne jest również opracowanie technologii, które umożliwiają przeprowadzanie skanów w czasie rzeczywistym. Technologie te, bazujące na odpowiednich algorytmach szybkiej rekonstrukcji obrazu, stają się nieocenione w zastosowaniach klinicznych, takich jak monitorowanie terapii fototermicznych czy ocena ukrwienia tkanek w czasie rzeczywistym. W tym kontekście, coraz częściej wykorzystuje się systemy oparte na układach mobilnych, co pozwala na łatwiejsze i szybsze przeprowadzanie badań w warunkach szpitalnych.

Wszystkie te innowacje są niezbędne, aby tomografia fotoakustyczna mogła stać się standardowym narzędziem diagnostycznym w medycynie. Chociaż technologia ta oferuje ogromny potencjał, wciąż istnieje wiele wyzwań związanych z poprawą jakości obrazów, zwłaszcza w kontekście ograniczonych danych i pasma sygnału. Jednak rozwój metod głębokiego uczenia, optymalizacja systemów oraz zastosowanie zaawansowanych algorytmów rekonstrukcji obrazu stanowią obiecujące kierunki, które mogą zrewolucjonizować tomografię fotoakustyczną i umożliwić jej szersze zastosowanie w praktyce klinicznej.

Pomimo ogromnych postępów w tej dziedzinie, warto pamiętać, że efektywność każdego systemu fotoakustycznego w dużej mierze zależy od jakości zastosowanego oprogramowania i algorytmów. Również wybór odpowiednich źródeł światła i detektorów, a także precyzyjna kalibracja układów pomiarowych, mają kluczowe znaczenie dla uzyskiwanych wyników. Należy także uwzględnić wyzwania związane z poprawą mobilności urządzeń i zmniejszeniem ich kosztów, aby technologia stała się bardziej dostępna, zwłaszcza w mniej rozwiniętych regionach świata.

Jakie materiały i procedury są optymalne dla tworzenia i walidacji fantomów w fotoakustycznym obrazowaniu (PAI)?

W modelowaniu właściwości tkanek dla potrzeb obrazowania fotoakustycznego (PAI) kluczowe znaczenie ma jak najdokładniejsze odwzorowanie parametrów akustycznych i optycznych tkanek biologicznych. Szczególnie istotne są wartości takie jak prędkość dźwięku i tłumienie akustyczne, które powinny być zgodne z odpowiadającymi im wartościami w tkance docelowej. Jeżeli możliwa jest kwantyfikacja dodatkowych właściwości – jak nieliniowy parametr ultradźwiękowy (B/A), współczynnik rozpraszania wstecznego, redukcja echa, gęstość czy parametr Grüneisena – również one powinny być jak najbliższe wartościom fizjologicznym. Kluczowe pozostaje to, by wszystkie wartości były powtarzalne i mierzone z wysoką precyzją.

W literaturze zidentyfikowano wiele materiałów używanych do budowy fantomów PAI, w tym hydrożele, PVA, silikon, PVCP oraz kopolimer w oleju. Każdy z nich oferuje inne właściwości i poziom stabilności. Szczególnie obiecujące w kontekście długoterminowej stabilności są materiały takie jak PVCP i kopolimery w oleju, ze względu na ich długi okres trwałości i doskonałe dopasowanie zarówno pod względem optycznym, jak i akustycznym. Z kolei hydrożele na bazie agaru, mimo ograniczonej trwałości, wyróżniają się prostotą i niskimi kosztami przygotowania.

Przykładowe procedury wytwarzania fantomów obejmują m.in. tworzenie kanałów wypełnionych cieczą lub wprowadzanie stałych absorberów takich jak przewody czy włókna. W przypadku kopolimeru w oleju, proces obejmuje dodanie materiałów rozpraszających i absorbujących do oleju mineralnego, ich sonikację w 90°C, a następnie dodanie polimerów i stabilizatora, ogrzewanie do 150°C, wylewanie do formy i pozostawienie do stwardnienia w temperaturze pokojowej. Dla agaru procedura jest prostsza: agar rozpuszcza się w wodzie dejonizowanej, dodaje się podgrzany intralipid oraz barwnik absorpcyjny (np. Nigrosin), a następnie wlewa się roztwór do formy i pozostawia do zestalenia.

Nie istnieje jeszcze standardowy, powszechnie akceptowany fantom dla PAI. Prace w tym kierunku prowadzone są przez IPASC (International Photoacoustic Standardisation Consortium), organizację zrzeszającą przedstawicieli środowisk akademickich, przemysłowych o

Jak działa fotoakustyczne ukierunkowanie fali świetlnej w biologicznych tkankach?

Większość tkanek biologicznych jest mętna, co wynika z przestrzennie zmiennego współczynnika załamania, który powoduje przypadkowe rozpraszanie światła. To ogranicza zakres działania technologii obrazowania optycznego, które polegają na skupianiu światła, ponieważ fotony mogą przemieszczać się jedynie na głębokość około 1 mm w tkance biologicznej, zanim ich kierunek zostanie znacząco zmieniony. Kształtowanie fali świetlnej pozwala na korekcję rozproszonego transportu światła przez zaburzone media, jak omówiono w poprzedniej sekcji. Niemniej jednak, metody te zazwyczaj wymagają kamery do rejestrowania informacji o polu świetlnym, co ogranicza ich zastosowanie w praktyce in vivo z powodu inwazyjnego charakteru tych podejść.

Aby rozwiązać ten problem, różne grupy badawcze poszukują alternatywnych sygnałów, które mogą służyć jako „gwiazdy prowadzące” do precyzyjnego kierowania skupieniem światła wewnątrz tkanek biologicznych. Te sygnały powinny być ściśle związane z lokalną intensywnością światła i możliwe do zmierzenia nieinwazyjnie. Przykłady to fluorescencja, dwa fotony, akusto-optyka, fotoakustyka i ruchome cząstki. Typowe konfiguracje układów zwrotnej informacji opartych na fluorescencji i akusto-optyce są pokazane na Rysunku 8.3. Ogólnie rzecz biorąc, gwiazdy prowadzące oparte na fluorescencji i dwóch fotonach wymagają specjalnych barwników (fluoroforów) do generowania sygnałów świetlnych o innej długości fali niż ta, którą emituje laser wzbudzający, podczas gdy akusto-optyczna gwiazda prowadząca jest bardziej elastyczna, ponieważ miejsce i rozmiar optycznego ogniska są definiowane przez przestrzenną lokalizację i rozmiar ogniska akustycznego. W porównaniu do zwrotnych sygnałów optycznych, gwiazda fotoakustyczna opiera się na silnie absorbujących tkankach, ponieważ przekształca światło wzbudzające w sygnały akustyczne, które mogą być mierzone zewnętrznie. Jest również doskonale dopasowana do zwiększania głębokości penetracji tkanek w obrazowaniu fotoakustycznym, poprawiając stosunek sygnału do szumu w sygnałach fotoakustycznych. Z tego powodu wzbudziła szerokie zainteresowanie badawcze.

Fotoakustyczne gwiazdy prowadzące mogą znacznie poprawić jakość obrazów fotoakustycznych, zwiększając głębokość penetracji w tkance oraz poprawiając jakość obrazowania dzięki wyższemu stosunkowi sygnału do szumu. W metodzie tej wykorzystuje się naturalne chromofory tkankowe, takie jak DNA/RNA, woda, lipidy czy hemoglobina, które eliminują konieczność stosowania zewnętrznych środków kontrastowych, co stanowi istotną zaletę w porównaniu do metod fluorescencyjnych. Dzięki zastosowaniu kształtowania fali świetlnej, lokalna fluencja światła w tkaninie może zostać znacząco zwiększona, co przekłada się na lepszy sygnał fotoakustyczny i wyższą jakość obrazów. Wzrost amplitudy fotoakustycznej jest ściśle związany ze wzrostem intensywności światła uzyskanym dzięki kształtowaniu fali, co zależy od strategii modulacji fali oraz liczby dostępnych trybów wejściowych.

Kluczową cechą tej technologii jest możliwość zastosowania różnych modulatorów, takich jak lustrzane elementy deformowalne (DM), przestrzenne modulatory światła (SLM) czy matryce cyfrowe (DMD). W praktyce, zastosowanie ultradźwiękowego transduktora do ukierunkowania fali świetlnej do ogniska akustycznego poprzez algorytmy iteracyjne pozwala na precyzyjne sterowanie miejscem ogniska świetlnego w tkaninie. W 2010 roku Kong i współpracownicy po raz pierwszy zademonstrowali wykorzystanie fotoakustycznych gwiazd prowadzących do ukierunkowania światła przez dyfuzor optyczny przy użyciu deformowalnego lustra i algorytmu ciągłej optymalizacji fali. W ich badaniach, po trzech iteracjach, udało się skoncentrować światło w ognisku akustycznym o średnicy 100 μm. Takie podejście umożliwia również uzyskanie sub-akustycznego ogniskowania światła, czyli skupienia światła w obszarach mniejszych niż rozmiar ogniska akustycznego, co zwiększa precyzję i rozdzielczość obrazów.

Zastosowanie fotoakustycznych gwiazd prowadzących do precyzyjnego kształtowania fali świetlnej stanowi obiecującą metodę w medycynie, szczególnie w obrazowaniu tkanek w głębokich warstwach. Ta technologia jest nadal w fazie intensywnych badań, ale jej potencjał do zastosowania w diagnostyce i terapii jest nieoceniony. Warto zauważyć, że rozwój takich technik wiąże się z ciągłym udoskonalaniem algorytmów optymalizacji i sprzętu, co pozwala na jeszcze dokładniejsze mapowanie wewnętrznych struktur biologicznych, zmieniając oblicze współczesnej medycyny i biologii.

Jak amerykańska historia migracyjnych restrykcji kształtowała wolność słowa i prawo do sprzeciwu?
Jak percepcje społeczne kształtują opinię publiczną w Stanach Zjednoczonych?
Jak obliczyć intensywność neutronów i gęstość prądu neutronów w reaktorze jądrowym?