Hvordan isolere og rense bakteriell membranvesikler: En praktisk tilnærming

For K. pneumoniae benyttes Luria-Bertani (LB) væskemedium ved å oppløse 10 g trypton, 5 g gjær-ekstrakt og 10 g natriumklorid i deionisert vann. Volumet justeres til 1 liter, og pH settes til 7,0. Mediet steriliseres ved autoklavering ved 120 °C i 20 minutter (ved 15 psi) på væskesyklus. For LB-agarplater tilsettes 15 g agar per liter LB før autoklavering. For S. pneumoniae benyttes C+Y, et kompleks definert væskemedium, som er beskrevet i annen litteratur. For å tilberede 1 liter C+Y, oppløses 5 g Bacto™ Casamino acids, 1,1 g gjær-ekstrakt og 1,2 g natriumacetat i deionisert vann. Deretter tilsettes løsninger med ulike næringsstoffer som L-tryptofan, L-cystein, L-glutamin og natriumpyruvat, sammen med løsninger som inneholder vitaminer og mineraler. Volumet justeres til 1 liter ved pH 7,9–8,0 ved bruk av natriumhydroksid. C+Y steriliseres ved autoklavering ved 120 °C i 20 minutter på væskesyklus. For blodagarplater tilsettes 15 g agar per liter TSA før autoklavering. Når blandingen har kjølt ned til 60 °C, tilsettes 5% steril, defibrinert fåreblod før platen helles.

Når det gjelder kultivering av bakteriene, kan et spektrofotometer benyttes for å lese absorbanse ved 600 nm for K. pneumoniae eller 620 nm for S. pneumoniae. Inkubasjonen skjer ved 37 °C i statiske forhold med 5% CO2. Bakteriene kultiveres i passende medier, og etter at ønsket optisk tetthet (OD) er oppnådd, fryses de ned for videre bruk.

I prosessen med å isolere membranvesikler fra bakterielle kulturer, benyttes en filtreringsenhet med et 0,22 μm PES-membran og vakuumpumpe. Supernatanten blir sentrifugert ved 5000 × g i 20 minutter ved 4 °C for å skille ut de intakte bakteriene fra de membranvesikler som ønskes isolert. Deretter filtreres supernatanten gjennom en PES-membranfilterenhet for å fjerne større partikler.

En ultracentifugering ved 130 000 × g ved 4 °C i minst 6 timer er nødvendig for å oppnå rensing av membranvesikler fra supernatanten. Etter dette fjernes supernatanten, og pelletet som inneholder membranvesiklene resuspenderes i PBS (phosphat-bufferet saltvann) for videre analyse.

Membranvesikkelene kan videre purifiseres ved hjelp av en OptiPrep-densitetsgradient. Dette innebærer å laste det crude membranvesikkelpreparatet på bunnen av et rør, og deretter overlagre det med ulike konsentrasjoner av OptiPrep-løsning. Når gradienten ultracentifugeres ved 155 000 × g i 8 timer ved 4 °C, dannes et synlig bånd som indikerer tilstedeværelsen av membranvesikler. De innsamlede fraksjonene vaskes for å fjerne eventuelle forurensninger og kan deretter lagres ved -80 °C for videre eksperimentering.

Proteiner fra membranvesiklene kan analyseres ved bruk av SDS-PAGE (polyakrylamidgel-elektroforese) for å bestemme proteinprofilen. Bakterielle membranvesikler kan også undersøkes ved elektronmikroskopi etter negativ farging, der vesiklene vises som klare ringstrukturer under mikroskopet.

Det er viktig å merke seg at det i denne prosedyren benyttes flere ulike teknikker og materialer for å oppnå renhet og stabilitet i de isolerte membranvesiklene. Når det gjelder ultracentifugering, er det viktig å sikre at rør og sentrifugeringsutstyr er korrekt kalibrert og at temperaturer holdes stabile, da selv små variasjoner kan påvirke resultatene. I tillegg bør vaskingen av membranvesikler gjennomføres grundig for å unngå kontaminasjon som kan forvride videre analyser.

Membranvesikler er viktige både som modell for studier av bakteriell cellemembranstruktur og for deres potensielle rolle i cellekommunikasjon. De kan inneholde et bredt spekter av biomolekyler, inkludert proteiner og lipider, som kan brukes til å forstå bakteriens virulensfaktorer eller for utvikling av vaksiner og terapeutiske mål.

Hvordan isolere og purifisere bakteriell membranvesikler (MV) fra gram-positive og gram-negative bakterier

Isolering og purifisering av bakteriell membranvesikler (MV) er en teknikk som har fått økt oppmerksomhet i mikrobiologi og infeksjonsforskning på grunn av deres potensielle rolle i patogenesen, immunrespons og som mulige biomarkører. MV er små, lipid-baserte strukturer som frigjøres fra bakterieceller, og de har blitt ansett som viktige mediatorer for bakterienes interaksjoner med vertsorganismen. Denne prosessen kan være teknisk utfordrende og krever presis håndtering for å sikre rene og funksjonelle vesikler som kan brukes til videre analyser.

I prosedyrene for isolering av MV benyttes ofte iodixanol (OptiPrep™) som et densitetsmedium. Dette er et isoosmotisk medium som forhindrer skade på membranens struktur under sentrifugering, og det er derfor et populært valg i prosessene som involverer gradient-sentrifugering. Det finnes imidlertid alternative medier som sukrose eller dekstran, som også kan benyttes, avhengig av spesifikke krav til eksperimentet.

En av de vanligste utfordringene ved isoleringen er det ofte lave utbyttet av MV, som kan gjøre det vanskelig å oppnå tilstrekkelige mengder for analyse. Bruken av ultraklare sentrifugerør kan hjelpe i disse tilfellene, da de gir bedre visibilitet av MV-ringen som dannes etter gradient-sentrifugering. I noen tilfeller, spesielt når det er svært lavt nivå av MV i kulturen, kan det være nødvendig å konsentrere kultur-supernatanten før sentrifugering ved hjelp av ultrafiltreringsteknikker. Dette gjør det mulig å fjerne de fleste proteiner som ikke er assosiert med MV, samtidig som MV-konsentratet opprettholdes.

For bakterier som frigjør svært lite MV, kan en alternativ tilnærming være å utføre pre-sentrifugering ved lavere hastigheter for å få en klar supernatant før filtrering. For eksempel, i tilfelle av slimete stammer av Streptococcus pneumoniae, kan det være nødvendig å sentrifugere ved høyere hastigheter for å oppnå en klar supernatant. Denne ekstra sentrifugeringen bidrar til å fjerne større partikler før filtrering, og sikrer en renere prøve for videre bearbeiding.

En annen viktig utfordring er at MV fra gram-positive bakterier, som S. pneumoniae, har en tendens til å være mindre tette og kan være vanskeligere å pelletere under ultracentrifugering. Det kan derfor være nødvendig med flere vasketrinn for å fjerne rester av iodixanol eller andre medier fra prøvene. Det er også viktig å merke seg at MV-preparater kan inneholde andre bakterielle strukturer, som pili eller flagella fragmenter, samt proteinkomplekser som kan forstyrre videre analyser. Derfor kan det være nødvendig å utføre flere vasketrinn for å sikre at MV-prøven er så ren som mulig før videre eksperimentering.

Når det gjelder kvantifisering av proteiner i MV, kan vanlige metoder som bovin serumalbumin (BSA)-assayet eller Qubit-fluorescensbaserte tester være mer nøyaktige enn den tradisjonelle Nanodrop-teknikken, som kan gi unøyaktige resultater på grunn av den høye lipidinnholdet i MV.

En annen potensiell utfordring i prosessen er det faktum at MV ofte varierer i størrelse avhengig av bakteriestamme og vekstforhold. Dette kan føre til at store MV blir selektivt fjernet i løpet av filtreringen, spesielt når man benytter filtere med et skjæreområde på 0,22 μm. Det er viktig å ta hensyn til dette for å sikre at alle ønskede vesikler blir bevart i prøven, særlig hvis man er interessert i å analysere vesikler som kan være større enn 200 nm.

For å oppsummere, isolering og purifisering av bakteriell membranvesikler innebærer en rekke tekniske utfordringer, men med presis håndtering og tilpassede metoder kan man oppnå rene vesikler som kan brukes til videre forskning. Det er viktig å forstå at prosessene kan variere avhengig av bakteriestamme, vekstforhold og ønsket sluttprodukt. Ytterligere vasketrinn, sentrifugeringsteknikker og kvantifisering av proteiner spiller en nøkkelrolle i å sikre kvaliteten på MV-prøvene.

Hvordan analysere frigjøring av NETs og celledød hos menneskelige nøytrofiler ved hjelp av flowcytometri og live-imaging mikroskopi

Analysen av nøytrofilers respons på bakterielle infeksjoner, spesielt frigjøring av NETs (Neutrophil Extracellular Traps) og cellens død, er et viktig verktøy for å forstå immunresponsens dynamikk i infeksjonsprosesser. Bruken av flowcytometri og live-imaging mikroskopi gjør det mulig å overvåke flere aspekter av disse prosessene med høy presisjon og i sanntid. For å gjennomføre en slik analyse er det flere kritiske trinn og komponenter som må tas i betraktning.

Først og fremst er forberedelsen av celleprøvene essensiell. Nøytrofilene, som er en av kroppens første forsvarslinjer mot infeksjoner, må isoleres nøye fra perifert blod. Denne prosessen innebærer bruk av standard medisinske prosedyrer for å samle blod, etterfulgt av sentrifugering og behandling med et spesifikt isoleringsreagens for å fjerne andre celletyper og sikre en ren nøytrofilfraksjon. Det er viktig at cellene deretter behandles forsiktig for å unngå skade, og de må være i et egnet medium for videre eksperimentell analyse.

For å vurdere celledød og frigjøring av NETs benyttes flere fargestoffer som spesifikt merker celler i forskjellige tilstander. Et av de vanligste fargestoffene for å analysere cellelevende og døde forhold er LIVE/DEAD™ Fixable Aqua dead cell stain, som gir et klart skille mellom levende og døde celler. Samtidig kan spesifikke fargestoffer som Annexin V FITC og 7-AAD brukes for å markere tidlige og sene stadier av apoptose, mens SYTOX Green benyttes for å merke nukleinsyrer i døde celler.

I tillegg til fargestoffer krever analysen bruk av en flowcytometer som kan håndtere flere fluorescerende kanaler samtidig. Dette gir mulighet for detaljert vurdering av cellepopulasjoner og deres respons på bakterielle stimuli. For eksempel, i en eksperimentell oppsett som benytter Attune NxT flowcytometer (ThermoFisher), er det mulig å skille mellom ulike fluorokrommer som MPO (myeloperoksidase), CD15, CD66b, Annexin V, og SYTOX Green, som gir en dyptgående forståelse av både NETs frigjøring og nøytrofilens dødsprosesser.

Når det gjelder studier av NETs frigjøring, benyttes ofte en kombinasjon av flowcytometri og live-imaging mikroskopi. I et live-imaging eksperiment blir cellene analysert i sanntid ved hjelp av et mikroskop utstyrt med et termoreguleringssystem for å opprettholde optimale vekstforhold for cellene. Dette gir mulighet til å observere dynamikken i NETs frigjøring under infeksjon eller andre stimulerte forhold. Bruken av spesifikke fargestoffer som Hoechst 33342 og SYTOX Green gjør det mulig å visualisere cellekjernene og de frigjorte NETs strukturene, samtidig som fluorescensmikroskopi kan benyttes for å analysere detaljene i prosessen.

Det er viktig å merke seg at både flowcytometri og live-imaging mikroskopi har sine styrker og begrensninger. Flowcytometri gir kvantitative data som tillater rask analyse av store cellepopulasjoner, mens live-imaging mikroskopi gir en mer detaljert, tidsbasert vurdering av de cellulære prosessene, men krever spesialutstyr og kan være mer tidkrevende.

Når man kombinerer disse metodene, kan forskeren få en dyptgående forståelse av hvordan nøytrofilene responderer på bakterielle infeksjoner, hvordan de dør, og hvordan de frigjør NETs som en del av immunforsvaret. En nøye vurdering av celledød, spesifikke proteinmarkører, og dynamikken i NETs frigjøring kan avsløre mye om mekanismene bak immunresponsen og kan være nyttig i utviklingen av nye terapeutiske strategier for behandling av infeksjoner eller inflammatoriske tilstander.

For å oppnå de mest pålitelige og reproduserbare resultatene i slike eksperimenter, er det avgjørende å sikre at alle prosedyrer gjennomføres under strenge kontrollerte forhold. For eksempel bør blodprøvene samles under aseptiske forhold, og alle bufferløsninger må være ferske og riktig blandet for å unngå forurensning eller skader på cellene. I tillegg bør man være oppmerksom på at standardisering av eksperimentelle betingelser, som tidspunkter for inkubasjon og dosering av stimulansmidler som PMA, kan ha en betydelig innvirkning på resultatene.

Analysene kan også dra nytte av programvare som FlowJo eller tilsvarende, som gjør det mulig å bearbeide og visualisere flowcytometridata på en effektiv måte, og dermed gjøre det lettere å trekke konklusjoner om dynamikken i NETs frigjøring og nøytrofilcelledød.

Hvordan gjennomføre infeksjoner med barcodestrains for å kvantifisere bakterieinteraksjoner i vertsceller?

For å studere bakterieinteraksjoner med vertsceller er det viktig å bruke infeksjonsmodeller som tillater nøyaktig sporing og kvantifisering av bakterienes tilstedeværelse i ulike celletyper. Bruken av barcoded konsortier, altså bakteriepopulasjoner merket med unike DNA-koder, gjør det mulig å utføre detaljert analyse av flere stammer samtidig. Denne metoden er spesielt nyttig når man ønsker å forstå hvilke bakteriestammer som er mest effektive i å binde seg til og invadere vertsceller som epitelceller, monocytter eller makrofager. I denne prosessen er det flere viktige trinn som må følges for å sikre pålitelige resultater.

Først forberedes bakteriekulturen, hvor bakterier med forskjellige barcode-merker dyrkes og forberedes for infeksjon. Etter at bakteriene er kultivert, kan de brukes til å infisere enten celler i kultur eller til å infisere dyremodeller som mus. Når infeksjonen utføres, er det viktig å bruke en kontrollgruppe som referanse, for eksempel en blanding av de ulike stammene som er merket med forskjellige barcodes. Dette gir et grunnlag for senere sammenligning av bakterienes relative abundans i forskjellige prøver.

Infeksjonsprotokollen kan variere avhengig av hvilken vertcelle man arbeider med. For eksempel, når man arbeider med U937 mononukleære celler eller makrofager, er det flere trinn som involverer celleforberedelse og infeksjon. Først må U937-cellene plasseres på et passende substrat for at de skal kunne feste seg. Deretter kan de infiseres med de aktuelle bakteriestammene. For makrofager er det nødvendig å differensiere mononukleære celler til makrofager før infeksjonen kan utføres, noe som innebærer spesifikke vekstbetingelser og tidsforløp.

I musemodeller kan streptomycinbehandling brukes før infeksjon for å drepe de fleste tarmbakteriene, og deretter kan musene infiseres med de merkede bakteriestammene. Etter infeksjonen, blir musecøkumet fjernet og behandlet for å isolere bakteriene. Denne prosessen inkluderer flere vasketrinn for å fjerne eksterne bakterier, etterfulgt av homogenisering av vevet for å samle bakteriene. Det er også viktig å bruke gentamicin for å drepe eventuelle bakterier som ikke har invadert vertscellene, slik at man kan isolere de intracellulære bakteriene som er mål for analysen.

Når bakteriene er isolert, kan de analyseres ved hjelp av kvantitative PCR (qPCR) for å bestemme hvilke stammer som er til stede i forskjellige prøver og i hvilken mengde. Denne analysen gir et mål for hvilke bakteriestammer som har vært mest suksessfulle i å invadere vertscellene og hvilke som har hatt størst vekst.

Ved qPCR-analysen benyttes taggprimerne til de ulike bakteriestammene, samt en felles bakoverprimer, for å kvantifisere DNA-et som stammer fra de merkede bakteriene. Dette gjør det mulig å analysere hvordan bakteriene interagerer med vertcellene og å sammenligne deres invasjonsevne under ulike betingelser. Det er viktig å utføre tekniske duplikater for hver reaksjon for å sikre pålitelige data.

I tillegg til de grunnleggende protokollene som er beskrevet for bakterieinfeksjoner og qPCR-analyse, er det flere faktorer som kan påvirke resultatene og bør tas i betraktning. For eksempel kan cellekulturforholdene, infeksjonsdosen, og valg av vertstype påvirke hvor effektivt bakteriene binder seg til cellene og invaderer dem. Det er også viktig å vurdere mulige feilkilder, som forurensning av prøvene eller ineffektiv bakteriedrap gjennom gentamicinbehandling.

Endelig kan det være nyttig å inkludere flere kontroller i eksperimentene, for eksempel en tom kontrollgruppe uten bakterier, for å vurdere bakgrunnsstøy og sikre at de observerte resultatene faktisk skyldes bakterieinteraksjoner med vertscellene. Videre kan det være nyttig å utføre tilleggseksperimenter, som for eksempel å blokkere spesifikke reseptorer på vertcellene for å undersøke hvilken rolle ulike molekyler spiller i bakterieinvasjonen.