De secundaire structuur van eiwitten wordt gekarakteriseerd door specifieke spiraal- en plaatvormige configuraties die ontstaan door de interacties tussen de peptidebindingen. Een van de meest kenmerkende structuren is de α-helix, maar er bestaan ook andere interessante helices zoals de 310-helix, de poly-Pro-helix en de collageenhelix, die elk hun eigen unieke eigenschappen en functies binnen eiwitten bezitten. Het begrijpen van deze structuren biedt inzicht in de stabiliteit en functionaliteit van eiwitten in biologische systemen.

De α-helix is wellicht de bekendste structuur en wordt gekenmerkt door een herhalend patroon van zeven aminozuren dat resulteert in een strak gewonden spiraal. Deze spiraal is het resultaat van waterstofbruggen die zich vormen tussen het koolstofyl (C=O) van het ene aminozuur en de amide-waterstof (N-H) van een ander aminozuur dat zich vier posities verderop in de keten bevindt. Dit leidt tot een stevige, stabiele configuratie die essentieel is voor de structuur en functie van vele eiwitten. Wanneer meerdere α-helices samenkomen, kunnen ze een "coiled-coil" vormen, waarbij de helices elkaar versterken door een karakteristiek patroon van inbeddings- en vergrendelingseffecten.

Naast de α-helix zijn er andere helixvormige structuren die bijdragen aan de variëteit van eiwitstructuren. De 310-helix is bijvoorbeeld korter en strakker gewonden dan de α-helix en heeft waterstofbruggen die zich vormen tussen residuen die drie plaatsen van elkaar verwijderd zijn, in plaats van vier zoals in de α-helix. Dit zorgt voor een kleinere radius, maar ook voor minder stabiliteit door de gepercipieerde sterische spanning tussen de zijketens die in lijn staan. De 310-helix komt vaak voor aan het uiteinde van α-helices en kan dienen als een capping-residu, wat helpt om de structuur van het eiwit te stabiliseren.

Poly-Pro-helices vormen ook een interessante uitzondering. In tegenstelling tot de meeste helices, die afhangen van waterstofbruggen voor stabiliteit, is de stabiliteit van de poly-Pro-helix voornamelijk te danken aan het minimaliseren van sterische botsingen tussen de proline-zijketens, die een rigide structuur hebben. Er bestaan twee typen poly-Pro-helices: type I, dat in oplosmiddelen voorkomt, en type II, dat de dominante vorm in water is en specifiek linksdraait. Dit type helix is vaak te vinden in kortere linkerregio's van multi-domeineiwitten en speelt een cruciale rol in de assemblage van eiwitcomplexen, zoals in SH3- en WW-domains.

De collageenhelix, die bestaat uit drie poly-Pro-II helices die samen een parallelle trimeer vormen, is een fundamenteel structureel element in collageen. Collageen is een van de meest voorkomende eiwitten in het lichaam en vormt de basis van weefsels zoals pezen, ligamenten, huid en kraakbeen. De drievoudige spiraal van collageen wordt stabiliseerd door waterstofbruggen tussen de glycine in de ene keten en de niet-proline aminozuren in de andere ketens. Het is door deze specifieke structuur dat collageen zijn buitengewone sterkte en flexibiliteit krijgt.

Naast de helical-structuren zijn er ook β-strengen, die uitgestrekte segmenten van de polypeptideketen zijn. De β-streng kan een stabiele configuratie bereiken door waterstofbruggen te vormen met andere β-strengen, wat resulteert in de vorming van β-bladen. Deze bladen kunnen parallel of antiparallel zijn, afhankelijk van de richting van de achtergronden van de betrokken strengen. De β-hairpin is een van de kleinste structuren die ontstaat door de interactie van twee β-strengen, en vormt de basis voor meer complexe supersecundaire structuren zoals β-meanders, Griekse sleutels en jellyrolls.

In veel gevallen zal een β-streng, wanneer hij wordt gecombineerd met andere secundaire structuren, bijdragen aan de stabiliteit van eiwitten en hun vermogen om bepaalde functies uit te voeren, zoals het binden van andere moleculen of het uitoefenen van enzymatische activiteiten. Deze structuren zijn niet alleen van fundamenteel belang voor de eiwitstructuur, maar ook voor de interacties tussen eiwitten in biologische systemen, waar precisie en stabiliteit essentieel zijn.

Het is belangrijk te beseffen dat de secundaire structuren van eiwitten niet statisch zijn. Ze kunnen variëren afhankelijk van de omgevingsomstandigheden, zoals pH, temperatuur en de aanwezigheid van cofactoren. Dit dynamische gedrag speelt een sleutelrol in de werking van eiwitten en hun interacties in levende systemen.

Hoe werkt de evolutie en structuurvoorspelling van eiwitten?

De huidige algoritmes voor eiwitvouwing volgen een vergelijkbare basisstrategie. Kort gezegd, worden de invoergegevens, bestaande uit sequenties en soms experimentele structuren, gebruikt voor de voorspelling van eiwitstructuren. In deze aanpak wordt informatie over co-evolutie van sequenties verzameld via een module die bekendstaat als de "MSA-transformer". Indien experimentele structurele gegevens beschikbaar zijn, wordt deze informatie geanalyseerd door een andere module, de "pair transformer", die de nabijheid van residuen in de ruimte bepaalt. Beide bronnen van informatie worden gecombineerd in een derde module, de "evoformer", die gebruikt wordt om de meervoudige sequentie-alignment (MSA) iteratief te verbeteren tijdens verschillende mini-cycli. Na deze eerste fase wordt de nabijheidsinformatie doorgegeven aan een "structuurmodule", die een eerste grove driedimensionale structuur genereert. Dit model wordt vervolgens geanalyseerd en bijgewerkt met nieuwe interacties tussen residuen, waarbij de MSA en de paarrepresentatie iteratief worden aangepast in grotere macrocylci.

Deze drie modules—MSA transformer, pair transformer en evoformer—gebruiken zogenaamde "attention mechanisms" om de belangrijkste delen van hun invoergegevens sterker te wegen, wat de nauwkeurigheid van de voorspellingen verhoogt. Het einddoel van dit iteratieve proces is het creëren van een structureel model dat dicht bij de werkelijke driedimensionale structuur van het eiwit ligt.

De sleutel tot de verbeteringen die zijn behaald met AlphaFold2 ligt in deze iteratieve verbinding van de modules. In tegenstelling tot de eerdere versies van sequentie-gebaseerde eiwitvouwing, maakt AlphaFold2 gebruik van deze uitgebreide interactie tussen sequentie-informatie, structurele gegevens (indien beschikbaar), en machine learning om de voorspellingen te verfijnen. Dit proces zorgt ervoor dat de modelvoorspellingen de nauwkeurigheid van 40% in 2018 aanzienlijk verhoogden naar meer dan 90% in 2022 voor verwante algoritmes.

De basis van dit proces begint met het verzamelen van gegevens uit een meervoudige sequentie-alignment (MSA). Idealiter moet dit MSA zeer groot zijn, soms bestaande uit duizenden sequenties. Hoewel het berekeningsintensief is, maakt een groot MSA de voorspelling van co-evolverende residuen veel robuuster. In gevallen waarbij het MSA slechts enkele tientallen sequenties bevat, kan de voorspelling minder betrouwbaar zijn zonder de hulp van experimentele structurele gegevens. Wanneer het MSA minstens enkele honderden sequenties bevat, kan het model volledig zonder experimentele gegevens worden gegenereerd.

Het proces begint met de conversie van een MSA naar een machineleesbare matrix via de MSA-transformer. Deze module wijst aan elk residu in een kolom een waarde van relatieve conservatie toe en identificeert correlaties tussen kolommen in de MSA. Deze correlaties worden omgezet in afstanden en opgeslagen in een zogenaamde "paarrepresentatie"-matrix, waar elke residu een kans krijgt toegewezen voor de co-existentie in de ruimte met elk ander residu. Deze matrix wordt vervolgens doorgegeven aan de pair transformer, die de afstandsinformatie omzet in een drie-dimensionaal model.

Wanneer experimentele structurele gegevens beschikbaar zijn aan het begin van de berekeningen, haalt de pair transformer de afstandsinformatie van dicht bij elkaar gelegen residuen op en voegt dit toe aan de paarrepresentatiematrix voordat het eerste model wordt berekend. In het geval dat er geen experimentele structurele gegevens aanwezig zijn, wordt het eerste model alleen op basis van de geschatte afstanden tussen residuparen en de waarschijnlijkheden van hun co-evolutie uit de MSA berekend.

Het eerste model is altijd onjuist, aangezien de initiële MSA vrijwel altijd misaligneringen bevat. Dit komt doordat verwante natuurlijke sequenties vaak van verschillende lengtes zijn, wat resulteert in inserties en deleties in de MSA. Aangezien de grootte van de inserties onbekend is, bevat elke MSA misaligneringen, wat betekent dat de zoektocht naar co-evolverende residuen noodzakelijkerwijs incompleet is. Dit maakt het des te moeilijker om co-evolverende residuen te identificeren naarmate ze verder van elkaar verwijderd zijn in de sequentie.

Echter, veel tertiaire structuurinteracties worden gelegd door residuen die ver van elkaar in de sequentie liggen. Daarom moeten zowel de MSA als het berekende model worden geoptimaliseerd door de evoformer. Dit gebeurt door het model dat door de pair transformer is berekend te analyseren voor residuen die dicht bij elkaar liggen, maar nog niet werden geïdentificeerd in de eerdere MSA. Door deze nieuwe residuparen worden de sequenties in de MSA verschoven of worden gaten van verschillende lengtes ingevoerd. Idealiter laat de bijgewerkte MSA zien dat de nieuwe residuparen co-evolueren.

De nieuwe residuparen worden toegevoegd aan de bijgewerkte paarrepresentatiematrix, die de pair transformer in staat stelt om een beter structureel model te berekenen. Dit proces van heen en weer pingpongen tussen de twee bronnen van informatie—de bijgewerkte MSA en de nieuwe residuparen uit het tussenmodel—verbeteren de voorspellingen iteratief. Het proces stopt pas na een vast aantal iteraties, wanneer opeenvolgende tussenmodellen niet meer verschillen dan een bepaald drempelwaarde, of wanneer het model voldoet aan de paargewijze afstandsbeperkingen die worden gegeven door de co-evolverende residuen.

Hoewel de individuele modules van het neurale netwerk goed bekend waren voor de komst van AlphaFold2, was de iteratieve verbinding tussen deze modules in de context van machine learning de sleutel tot de significante verbetering die dit algoritme mogelijk maakte. De doorbraak leidde tot een verbetering in de nauwkeurigheid van de voorspellingen van 40% naar meer dan 90% voor verwante algoritmes. De evolutie van deze technologie heeft de vooruitzichten voor structurele biologie en eiwitvouwing ingrijpend veranderd en biedt nieuwe mogelijkheden voor onderzoek en toepassing.

Hoe Ionfragmentatie en Sequencing Werk in Massaspectrometrie

In massaspectrometrie is het van essentieel belang om moleculaire ionen te fragmenteren om hun samenstelling nauwkeurig te kunnen analyseren. Dit proces, vaak toegepast bij de analyse van macromoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren, maakt gebruik van verschillende technieken om fragmenten van de oorspronkelijke ionen te genereren, die vervolgens kunnen worden gemeten en geanalyseerd met hoge precisie.

Ionfragmentatie is de sleutel tot het verkrijgen van gedetailleerde informatie over de structuur van een molecuul. Bij de analyse van macromoleculen wordt vaak gekozen voor fragmentatie, omdat kleinere ionen gemakkelijker geanalyseerd kunnen worden met hogere nauwkeurigheid. Sequencing, zoals dat van eiwitten en nucleïnezuren, is gebaseerd op het genereren van een reeks fragmenten die verschillen in massa door één aminozuur of nucleotide. Dit proces volgt meestal een strategie waarin eerst een volledige massa-spectrum van het monster wordt verzameld, daarna een bepaald fragment op basis van de massa/charge-verhouding (m/z) wordt geïsoleerd en verder geanalyseerd in een tweede MS-run.

De techniek van ionfragmentatie houdt in dat chemische bindingen in de moleculen worden verbroken, wat leidt tot de vorming van kleinere ionen die gemakkelijker kunnen worden gemeten. Het fragmenteren van moleculen kan op verschillende manieren gebeuren: door elektronenbombardement, lichtirradicatie (zoals bij MALDI) of door botsingen tussen ionen en gasmoleculen in ionvallen of driftbuizen. De keuze van de fragmentatiemethode hangt vaak af van het type monster en de gewenste resolutie van de analyse.

In de praktijk wordt de ionfragmentatie vaak uitgevoerd door een proces genaamd collision-induced dissociation (CID), waarbij ionen in een ionval of driftbuis met een dragend gas botsen, wat leidt tot de breuk van chemische bindingen. Deze fragmentatie resulteert in dochterionen die vervolgens kunnen worden geanalyseerd. Het gebruik van tandemmassaspectrometrie (MS/MS), waarbij meerdere massaanalyzers worden gebruikt om de fragmentatie in verschillende stappen te analyseren, is een veelgebruikte strategie om gedetailleerde informatie over de moleculaire structuur te verkrijgen.

De fragmentatie van peptiden, bijvoorbeeld, gebeurt voornamelijk langs de peptidebindingen. De resulterende fragmenten worden geanalyseerd op basis van hun m/z-verhouding, wat uiteindelijk leidt tot de bepaling van de aminozuursequentie van het peptide. De massa van elk fragment wordt vergeleken met de sequentie van de originele peptide om de aminozuursamenstelling te reconstrueren. Soms kan fragmentatie op meerdere plekken binnen dezelfde peptide optreden, wat leidt tot de vorming van interne ionen en complexere massa-spectra.

In sommige gevallen kunnen fragmenten ontstaan door de afbraak van zijketens van aminozuren. Deze zijketenfragmenten kunnen de interpretatie van massa-spectra bemoeilijken, omdat ze de spectra complexer maken. Desondanks biedt het gebruik van fragmenten uit verschillende plaatsen van de molecule waardevolle informatie voor het identificeren van onbekende moleculen.

Naast de ionfragmentatie en sequencetechnieken speelt de detectie van de gegenereerde ionen een cruciale rol in massaspectrometrie. Verschillende detectoren worden gebruikt om de ionen te detecteren nadat ze zijn gefragmenteerd en geanalyseerd. Ion-tot-foton detectoren, elektronenvermenigvuldigers en microkanaalplaten zijn enkele van de meest gebruikte detectoren. Het principe achter deze detectoren is dat ionen met hoge energie botsen met een scintillerende stof, die vervolgens fotonen genereert. Deze fotonen worden gedetecteerd door een fotomultiplierbuis, wat resulteert in een meetbare elektrische stroom. Elektronenvermenigvuldigers werken op basis van een cascade van elektronen, waarbij een eerste signaal wordt versterkt door ionen die botsen met dynodes en meer elektronen vrijgeven. Uiteindelijk wordt dit signaal versterkt tot een meetbare stroom op het laatste elektrode, de detectieanode.

In het gebruik van tandemmassaspectrometrie wordt de fragmentatie van moleculen vaak in meerdere fasen uitgevoerd. Dit maakt het mogelijk om met een hoge mate van precisie de aminozuurvolgorde van eiwitten of de nucleotidevolgorde van nucleïnezuren te bepalen. Het verkrijgen van een gedetailleerd spectrum van ionfragmenten is cruciaal voor het begrijpen van de structuur van complexe moleculen en het identificeren van onbekende verbindingen.

Naast deze technieken is het belangrijk te begrijpen dat de keuze van de fragmentatiemethoden en de massaspectrometrische analyse van invloed kan zijn op de kwaliteit van de verkregen gegevens. De omstandigheden waaronder de fragmentatie plaatsvindt moeten zorgvuldig worden gecontroleerd om reproduceerbaarheid te waarborgen en nevenreacties te minimaliseren die de interpretatie van de spectrale gegevens kunnen compliceren. Dit geldt vooral bij de analyse van complexe mengsels of bij het werken met moleculen die een lage ionisatie-efficiëntie hebben.

Hoe het kapitalisme de samenleving verdeelt: De impact van de neoliberale politiek
Hoe beïnvloedt de bescherming van microgrids de veiligheid en effectiviteit van een elektriciteitsnetwerk?
Hoe Verbetert het SSGCC-model de Clustering van Hyperspectrale Beelden?
Hoe kies je de juiste statistische test bij categorische of cardinale afhankelijke variabelen?
Welke rol speelt Cornwall in de werken van beroemde auteurs en hoe beïnvloedt de natuur hun creaties?
Wat zijn de uitdagingen en mogelijkheden voor de ontwikkeling van brandstofcel- en waterstoftanksystemen voor massatransporttoepassingen?