Wat is de invloed van verstrooiing op de polarisatie van fluorescentie?

In een fluorescentiemeting is de invloed van parasitaire lichtverstrooiing relatief klein, zolang het lichtniveau laag is en het direct door de oplossing heen gaat. Bij aanzienlijke verstrooiing kan echter een deel van dit parasitaire licht naar de emissiezijde worden geleid, waardoor het door een langepasfilter kan passeren en de detector kan bereiken. Bij polarisatiemetingen zal verstrooiing de waargenomen polarisatie verhogen, alsof er directe Rayleigh-verstrooiing de detector bereikt. Als parasitair licht aanwezig is, kan een interferentiefilter in de excitatiepad worden geplaatst, dat de excitatiegolfband doorlaat om het licht te 'schoonmaken' (oftewel de Rayleigh-geesten te verwijderen). Het is gebruikelijk dat onderzoekers die regelmatig werken met monsters die aanzienlijke verstrooiing veroorzaken — zoals membraansystemen — fluorimeters gebruiken met een dubbele monochromator in de excitatiepad. Dit arrangement heeft als voordeel dat het licht dat op het monster valt spectraal zeer puur is, maar het nadeel dat de intensiteit van de excitatie aanzienlijk wordt verminderd in vergelijking met een enkele monochromator-excitatie.

Joseph Eisinger en Jorge Flores beschreven in 1985 hoe anisotropiemetingen bij afnemende hematocrieten de extrapolatie mogelijk maakten naar een anisotropiewaarde die gecorrigeerd was voor het effect van verstrooiing. Dit effect van verstrooiing op polarisatie kan ook worden waargenomen door de polarisatie van een verdunde glycogeenoplossing in een absorptie-cuvette te meten. In mijn eigen laboratorium heb ik dergelijke oplossingen vaak gebruikt om de uitlijning van de polarisatoren te controleren. Wanneer alles goed is uitgelijnd (en ik een fluorescentiecuvette gebruik), verwacht ik een polarisatie groter dan 99% (d.w.z. 0,995). Wanneer ik echter de oplossing in een absorptie-cuvette plaatste, met de matte kant naar de emissiezijde, zag ik slechts een polarisatie van 90%.

Een belangrijk mechanisme voor depolarisatie is de overdracht van opgewonden-state-energie, oftewel FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Zoals geïllustreerd in de literatuur, zal zowel de roterende diffusie van een opgewonden dipool als de overdracht van opgewonden-state-energie van de ene dipool naar een andere met een andere oriëntatie leiden tot een verandering in de waargenomen polarisatie van de emissie. Dit verschijnsel wordt in hoofdstuk 9 verder besproken.

Het is ook belangrijk om te realiseren dat niet alleen de apparatuur, maar ook de monsteromstandigheden een significante invloed kunnen hebben op de metingen. Troebelheid, verstrooiing en absorptie van het monster zelf kunnen de resultaten beïnvloeden, en daarom is het noodzakelijk om deze effecten goed te begrijpen en er in de meetopstelling rekening mee te houden. Het gebruik van de juiste filters en het optimaliseren van de spectrale zuiverheid van de excitatie is essentieel voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten.

Wat zijn de gevolgen van zelf-quenching bij fluoroforen in vesicles?

Bij fluoroforen die in vesicles worden geplaatst, kan een overmatige concentratie van deze moleculen leiden tot zelf-quenching. Dit gebeurt wanneer de concentratie van de fluoroforen zo hoog is, bijvoorbeeld bij carboxyfluoresceïne in concentraties groter dan 100 mM, dat de fluorescente eigenschappen van de moleculen worden onderdrukt door intermoleculaire interacties. Dit fenomeen wordt versterkt in de afwezigheid van andere opgeloste stoffen of naarmate de dichtheid van de fluoroforen toeneemt binnen een specifieke vesiclepopulatie. De quenching wordt voornamelijk veroorzaakt door collisies tussen moleculen, die hun excitatietoestand ondermijnen.

Echter, wanneer deze vesicles met een lagere concentratie fluoroforen fuseren met andere, niet-gemerkte vesicles, kan er een verdunning optreden die het zelf-quenching effect oplost. Het verlagen van de concentratie van de fluoroforen voorkomt de direct onderling contact, wat betekent dat de fluoroforen niet langer in hun gequenchde staat verkeren. Dit mechanisme maakt gebruik van de veranderingen in fluorescerende intensiteit om de dynamiek van de vesicles en de interactie tussen moleculen te bestuderen, zoals geïllustreerd in de bijgevoegde afbeelding (figuur 8.12, onder).

Naast collisies en complexvorming, die de meest voorkomende mechanismen van quenching zijn, zijn er ook andere manieren waarop energie-uitwisseling kan plaatsvinden. Een dergelijke methode is het fenomeen van FRET (Förster Resonance Energy Transfer), waarbij de energie van een geëxciteerde donorfluorofore overgaat naar een acceptor, wat leidt tot depopulatie van de geëxciteerde toestand van de donor. FRET heeft een brede toepassing in biosensoren en moleculaire beeldvorming, met name in Fluorescent Lifetime Imaging Microscopy (FLIM). De mechanismen van FRET zullen uitgebreider besproken worden in hoofdstuk 9.

Een van de meest interessante studies over quenching werd uitgevoerd door Marcelo H. Gehlen, die in zijn werk de impact van de Stern-Volmer vergelijking op de fluorofore quenching in detail behandelt. Voor lezers die zich verder willen verdiepen in de theorie en toepassing van fluorescencequenching, wordt verwezen naar de aanvullende literatuur, waarin de mechanismen van quenching uitgebreid zijn behandeld in verschillende studies, zoals die van M.R. Eftink, T.J. Selva, en Z. Wasylewski, evenals andere fundamentele artikelen van M. Levitus en J.R. Lakowicz.

Het begrip FRET, hoewel al meer dan een eeuw bekend, heeft in recente decennia een enorme populariteit verworven, voornamelijk door de vooruitgang in de technologieën die nodig zijn om FRET-experimenten in de praktijk uit te voeren. In de biowetenschappen wordt FRET tegenwoordig veel gebruikt om de interacties tussen moleculen te bestuderen. Dit kan gaan om ligand-receptorinteracties, de conformationele veranderingen van biomoleculen, of zelfs de dynamiek van eiwit-vorming en -vouwen. FRET biedt bovendien unieke inzichten in de moleculaire interacties binnen biologische membranen, nucleïnezuren en eiwitcomplexen.

Van belang voor de lezer is dat, hoewel FRET een krachtig hulpmiddel is om de nabijheid van moleculen te bepalen, het geen absolute maat is voor de exacte afstanden tussen moleculen. Er zijn veel factoren die de nauwkeurigheid van FRET-metingen kunnen beïnvloeden, zoals de spectroscopische eigenschappen van de gebruikte fluoroforen, de oriëntatie van de donor- en acceptormoleculen, en de plaatselijke omgeving van de moleculen. Deze factoren moeten zorgvuldig worden gecontroleerd om betrouwbare en herhaalbare resultaten te verkrijgen.

Het is daarnaast belangrijk om te realiseren dat FRET, net als andere spectroscopische technieken, beperkingen kent. De efficiëntie van de energieoverdracht is afhankelijk van de spectrale overlap tussen donor en acceptor, evenals de afstand tussen hen, die typisch niet verder dan enkele nanometers mag zijn voor een efficiënte overdracht. FRET wordt dus vooral gebruikt voor het bestuderen van moleculen die relatief dicht bij elkaar staan, zoals in geval van eiwit-proteïne-interacties of bij het bestuderen van veranderingen in de structuur van biomoleculen onder bepaalde fysiologische omstandigheden.