Het dynamische gedrag van tryptofaanresiduen, zoals geïllustreerd door de interactie met Ts (Translational Elongation Factor Ts) en TuGDP (tRNA-gebonden Guanosine-difosfaat), is een belangrijk onderwerp binnen de studie van fluorescente spectroscopie. De experimentele gegevens tonen aan dat het tryptofaanresidu in TuGDP een opmerkelijk beperkte lokale mobiliteit vertoont. Bij binding met Ts echter, neemt de lokale mobiliteit van dit residu aanzienlijk toe, wat zich uit in een verhoogde depolarisatie van het fluorofoor. Dit fenomeen toont aan dat de dynamiek van fluoroforen niet alleen afhankelijk is van de grootte van het molecuul, maar ook van de moleculaire omgeving en de interacties tussen de verschillende componenten in het systeem. De steady-state polarisatie van TuGDP was bijvoorbeeld hoger dan die van TuTs, wat op het eerste gezicht tegenintuïtief lijkt, gezien het kleinere formaat van TuGDP in vergelijking met TuTs. Dit resultaat benadrukt het belang van tijd-resolutie data bij het interpreteren van dynamische fluorescent

Wat is de betekenis van phasor- en FLIM-technieken in de studie van eiwitinteracties en cellulaire processen?

De phasor-techniek heeft zich bewezen als een krachtige methode voor het bestuderen van de interacties tussen liganden en eiwitten, waarbij veranderingen in de richting van de phasorpunten optreden bij verhoogde kaliumconcentraties. Dit wordt duidelijk wanneer men trypthofaanfluorescentie onderzoekt in aanwezigheid van een enkel ligand, gevolgd door titratie van een tweede ligand. Door het omdraaien van de volgorde van ligandbinding en het opnieuw uitvoeren van de phasormeting, wordt duidelijk dat bij titratie van een tweede ligand in een binair complex de phasorwaarden zich verplaatsen naar een uniek phasorpunt in het diagram, wat aangeeft dat er verschillende unieke conformaties van het enzym bestaan. Het ternair complex vertoont een specifiek phasorpunt, dat ongeacht de volgorde van titratie (substraat gevolgd door inhibitor of vice versa) consistent is. Deze resultaten suggereren de aanwezigheid van vier verschillende conformaties van het enzym, elk gekarakteriseerd door een uniek phasorpunt. Dit bevestigt de geschiktheid van Weber's thermodynamische benadering voor dit systeem, die een breuk vormt met het traditionele tweestatenmodel, zoals het MWC-model.

Fluorescentielevensduurmetingen werden voor het eerst uitgevoerd met een microscoop in 1959 door Benjamin D. Venetta, die de levensduur van proflavine in de kernen van tumorcellen onderzocht met behulp van een zelfgebouwd frequentiedomeininstrument. Dit instrument gaf echter geen mogelijkheid voor gedetailleerde levensduurbeeldvorming. Werkelijke FLIM-instrumenten (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) werden pas in 1988 en 1989 ontwikkeld door Gärtner et al. en X.F. Wang et al. respectively. Deze technologie heeft sindsdien enorme vooruitgangen geboekt, vooral op het gebied van celbiologische studies. FLIM maakt het mogelijk om levensduurmetingen van fluorescerende moleculen op een pixel-voor-pixel basis in beeld te brengen, wat van groot belang is omdat de levensduur van fluorescentie niet afhankelijk is van de hoeveelheid fluoroforen, maar van de processen die zich in de aangeslagen toestand van die moleculen voordoen.

Een belangrijk voordeel van FLIM is dat het niet alleen de intensiteit van de fluorescentie meet, maar ook de levensduur van de fluorescerende moleculen die in het beeld aanwezig zijn. Dit kan cruciale informatie opleveren over moleculaire interacties, zoals FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Wanneer FRET optreedt tussen een donor- en een acceptormolecuul, zal de levensduur van de donor afnemen, wat een bewijs is van de vorming van een eiwitcomplex. Echter, het ontbreken van een FRET-signaal betekent niet noodzakelijkerwijs dat een complex niet is gevormd, aangezien de afstand en oriëntatie tussen de donor en acceptor ongeschikt kunnen zijn voor FRET.

FLIM in live cellen wordt echter gecompliceerd door het feit dat een pixel in een FLIM-afbeelding meestal slechts tussen de 500 en 1000 fotonen bevat. Dit maakt het moeilijk om een precieze levensduur te verkrijgen, vooral als er meerdere levensduurcomponenten aanwezig zijn. Daarnaast moet men rekening houden met autofluorescentie, wat de analyse van de donorlevensduur verder bemoeilijkt. Daarom heeft de phasor-benadering steeds meer toepassing gevonden binnen FLIM-onderzoeken. In 2004 introduceerden Andrew Clayton, Quentin Hadley en Peter Verveer een grafische methode voor het weergeven van de pixels in een FLIM-afbeelding. Hun benadering gebruikte Weber’s 1981-algoritme om twee levensduurcomponenten in FLIM-gegevens met slechts één frequentie van lichtmodulatie te onderscheiden. Later, in 2005, publiceerden Clayton en Hadley een meer gedetailleerde uitleg van deze benadering, bekend als de AB Plot, en Glen Redford en Robert Clegg introduceerden de Polar Plot, die een alternatieve manier bood om FLIM-gegevens te analyseren.

Een belangrijke vooruitgang in deze techniek werd bereikt door Enrico Gratton en zijn team in 2005, die een paradigma-shift introduceerden in de toepassing van phasors voor FLIM. Hun benadering was conceptueel volledig anders dan voorgaande werken. Ze koppelden de pixels in een FLIM-afbeelding aan de phasorpunten die deze pixels vertegenwoordigen in de bijbehorende phasordiagrammen. Dit stelde onderzoekers in staat om een cursor op een bepaald punt in het phasordiagram te plaatsen en de bijbehorende pixels in de afbeelding te markeren, die overeenkomen met die specifieke phasorwaarden. Deze aanpak biedt een krachtige tool voor het visualiseren van de dynamiek van eiwitinteracties in levende cellen en wordt steeds vaker toegepast in cellulaire biologie, zoals aangetoond door verschillende publicaties van Gratton en zijn medewerkers.

In recente studies, zoals de werken van Malacrida et al. (2021), is de phasorbenadering verder geoptimaliseerd, wat de interpretatie van FLIM-gegevens uit cellulaire systemen aanzienlijk heeft verbeterd. De toepassing van deze benadering biedt een gedetailleerder inzicht in de dynamiek van biomoleculaire interacties in real-time, waardoor het niet alleen mogelijk is om de aanwezigheid van interacties vast te stellen, maar ook om de verschillende stadia van die interacties in kaart te brengen.

Bij de studie van FLIM en FRET in cellen is het cruciaal te begrijpen dat een verandering in de fluorescentielevensduur vaak een subtiele, maar diepgaande wijziging in de moleculaire dynamiek van de betrokken systemen weerspiegelt. Dit is belangrijk omdat dergelijke veranderingen vaak inzicht geven in de functionele status van cellulaire processen, zoals eiwitvouwen, complexe vorming en enzymatische activiteit, zonder dat invasieve methoden nodig zijn. Het is dus van essentieel belang om de nuances van levensduurmetingen en de bijbehorende phasorbenaderingen volledig te begrijpen voor een effectieve toepassing in celbiologie en andere biomedische onderzoeken.

Hoe de Diffusiemodel en Grensvoorwaarden Toepassen in Reactor Fysica
Hoe Waarheid en Leugen Samenkomen in Politieke Vertellingen: Een Dieper Inzicht
Hoe de Citrilvink zich onderscheidt van andere vinkensoorten: Gedrag, zang en habitat
Heeft de pers recht om beloften te breken? De impact van beloftebreuk en de persvrijheid