Hoe beïnvloeden hydrophobe interacties de stabiliteit van eiwitten en hun vouwing?

De stabiliteit van eiwitten is sterk afhankelijk van de manier waarop watermoleculen zich gedragen rond de hydrofobe zijketens van de aminozuren. In de onvervouwen toestand van een eiwit bevinden zich geordende watermoleculen rond deze hydrofobe zijketens. Wanneer het eiwit vouwt, wordt een aanzienlijk aantal van deze watermoleculen losgelaten in het oplosmiddel, wat enerzijds de stabiliteit bevordert, maar anderzijds ook een energetische kosten met zich meebrengt. De sterke waterstofbruggen die tussen de geordende watermoleculen in de onvervouwen staat bestaan, worden gebroken, en de zwakkere waterstofbruggen die in het oplosmiddel worden gevormd, leiden tot een toename van de enthalpie. Deze overgang draagt bij aan de hogere warmtecapaciteit van onvervouwen eiwitten in vergelijking met hun gevouwen toestand, zoals duidelijk wordt uit de theorie van de specifieke warmtecapaciteit (Cp) (Hoofdstuk 1.6.2).

Een stabiel, monomeer eiwit heeft doorgaans weinig hydrofobe zijketens aan zijn oppervlak. Wanneer hydrofobe restgroepen wel aanwezig zijn, bevinden zij zich vaak geïsoleerd en worden ze omgeven door hydrofiele zijketens. Wanneer clusters van hydrofobe aminozuren zich aan het oppervlak van een eiwit bevinden, duidt dit meestal op een interactieplaats voor eiwit-eiwitinteracties. Terwijl de verberging van hydrofobe restgroepen in de kern van een eiwit de belangrijkste drijvende kracht is voor de vouwingsdynamiek, hebben hydrofiele aminozuren minder invloed op de stabiliteit van het eiwit. Deze hydrofiele aminozuren bedekken het oppervlak van oplosbare eiwitten en vormen waterstofbruggen, hetzij met elkaar, hetzij met watermoleculen. Dit is een sterk contrast met de waterstofbruggen die worden gevormd door de hoofdketen en zijketengroepen die zich in de hydrofobe kern van het eiwit bevinden. Deze bedekte waterstofbruggen hebben een veel grotere energetische bijdrage aan de stabiliteit, omdat ze niet concurreren met de waterstofbruggen die met oplosmiddelmoleculen worden gevormd. Bovendien is de interactie tussen deze waterstofbruggen sterker in omgevingen met een lage diëlektrische constante.

Hoewel het grootste deel van het water uit de hydrofobe oppervlakken wordt verwijderd bij de vouw van het eiwit, kan water in sommige gevallen toch in een niet-polaire holte van de eiwitkern terechtkomen. Ongeveer 1% van de eiwitkern is niet volledig verpakt met zijketens. Een suboptimaal verpakte hydrofobe kern vermindert de van der Waals-contacten tussen de zijketens en verhoogt tegelijkertijd hun entropie. Beide effecten zijn energetisch ongunstig en destabiliseren het eiwit. Dit verklaart waarom de natuur "een vacuüm verafschuwt" (horror vacui) in de eiwitkern.

In thermofiele organismen is de stabiliteit van eiwitten vaak groter dan bij mesofiele organismen, wat grotendeels te danken is aan de perfecte verpakking van de hydrofobe kern, zonder holtes. Echter, wanneer de holte groter is dan het volume van een watermolecuul (meer dan 30 Å3), zal water het moeten vullen. Een enkel watermolecuul in een hydrofobe omgeving heeft beperkte interacties, omdat het geen waterstofbruggen kan vormen. Ten minste drie watermoleculen moeten worden gevangen om twee waterstofbruggen te vormen, wat een minimumvolume voor een oplosmiddelgevulde holte bepaalt. In feite zijn hydrofobe holtes in eiwitten ofwel klein en leeg, of groot genoeg om minimaal drie watermoleculen te herbergen. Meer dan 90% van de watermoleculen die in hydrofobe holtes worden vastgehouden, zijn hoog georganiseerd en vormen 3-4 waterstofbruggen per molecuul.

Naast water kunnen ook co-oplosmiddelen invloed hebben op de stabiliteit van eiwitten. Zouten zijn een opvallend voorbeeld, omdat ze zowel de native als de onvervouwen toestand van eiwitten kunnen stabiliseren, afhankelijk van de aard van het zout. De Hofmeister-serie, die de effecten van zouten op eiwitsolubiliteit en -stabiliteit rangschikt, helpt om deze invloeden te begrijpen. Zouten aan de linkerkant van de serie, zoals ammoniumsulfaat, verminderen sterk de oplosbaarheid van eiwitten door de hydrophobe interactie te versterken, wat de native staat stabiliseert. Aan de andere kant stabiliseren zouten aan de rechterkant van de serie, zoals guanidiniumthiocyanaat, de onvervouwen toestand door de hydrophobe interactie te verminderen.

De effecten van deze zouten zijn nauw verbonden met het concept van 'salting in' en 'salting out'. Ammoniumsulfaat stabiliseert de native staat door het eiwit te precipitateren, wat nuttig is in technieken zoals eiwitzuivering en concentratie. Guanidiniumchloride en ureum daarentegen werken als chaotropen, die de hydrophobe interacties verminderen en de eiwitten destabiliseren, wat leidt tot het ontvouwen van het eiwit. Deze stoffen worden vaak gebruikt in laboratoria voor het denatureren van eiwitten, bijvoorbeeld in de polyacrylamide-gel-elektroforese.

Hoewel watermoleculen en co-oplosmiddelen een significante invloed hebben op de stabiliteit van eiwitten, is het belangrijk te begrijpen dat de stabiliteit van het gevouwen eiwit verder wordt bepaald door de interacties tussen de zijketens van aminozuren, de vouwingsdynamiek en de thermodynamica van het proces zelf. Het is de complexe afwisseling van energie-afgifte en -opname door middel van hydrophobe interacties, waterstofbruggen en ionaire interacties die de uiteindelijke stabiliteit en functionaliteit van het eiwit bepaalt.

Hoe Koppeling van Protonatie- en Conformatieverhoudingen de Enzymfunctie Beïnvloedt

Wanneer enzymen zich in verschillende protonatie-toestanden bevinden, heeft de verandering in pH een diepgaande invloed op hun werking. Dit fenomeen kan in de biochemie worden begrepen door het concept van de zogenaamde 'schijnbare protonatieconstante', die het effect van zowel protonatie als conformatiwijzigingen van enzymen beschrijft.

Bij een lage pH zijn enzymen meestal geprotoneerd, wat betekent dat hun activeringsstatus en activiteit kunnen worden beïnvloed door de beschikbaarheid van protonen. In dit geval benadert de schijnbare protonatieconstante, Kapp, de werkelijke protonatieconstante, KA. Dit is een essentieel mechanisme voor het functioneren van enzymen, omdat de structuur en functie van het enzym vaak afhankelijk zijn van de protonatiegraad van bepaalde residuen.

Bij een hogere pH wordt het enzym gedeprotoneerd, waardoor de schijnbare protonatieconstante weer dicht bij de werkelijke waarde van de dissociatieconstante (K) komt. Dit benadrukt het belang van pH als een reguleerbare factor die de enzymwerking kan sturen. De inflectiepunt van deze pH-afhankelijkheid, bij pH = pKA, mark

Hoe beïnvloedt het kinetische isotopische effect de snelheid van chemische reacties?

Het kinetische isotopische effect (KIE) is een belangrijk concept in de biochemie en scheikunde, dat betrekking heeft op de invloed van isotopen op de snelheid van chemische reacties. Dit effect kan de studie van reacties aanzienlijk verbeteren, vooral wanneer de reactie wordt gekatalyseerd door enzymen. De fundamentele oorzaak van het kinetische isotopische effect is het verschil in massa tussen isotopen van een element, bijvoorbeeld tussen waterstof (H) en deuterium (D), waarbij deuterium een massa van twee heeft in vergelijking met waterstof, wat de massa verdubbelt. Dit verschil in massa beïnvloedt de trillingsfrequentie van de chemische bindingen waarin deze isotopen zich bevinden, wat op zijn beurt de snelheid van de reactie beïnvloedt.

Wanneer een H-D-uitwisseling plaatsvindt in een chemische reactie, heeft de vervanging van waterstof door deuterium de neiging de activatie-energie voor het verbreken van de binding te verhogen, vooral als de reactie afhankelijk is van het verbreken van een C-H (of C-D) binding. Dit verhoogde activatie-energie leidt tot een verminderde reactiesnelheid, aangezien de C-D binding trager wordt verbroken dan de C-H binding. Dit resulteert in een lagere snelheid van de reactie, wat typisch wordt waargenomen als een primair kinetisch isotopisch effect. Het primaire effect wordt meestal waargenomen wanneer de breuk van de binding de snelheidsbeperkende stap in een reactie is, zoals weergegeven in de figuren in de studie.

Er is echter ook een secundair kinetisch isotopisch effect, dat optreedt wanneer de vervanging van H door D plaatsvindt op een andere binding die niet de snelheidsbeperkende stap van de reactie is. Dit effect is vaak te zien wanneer de vervangende binding in vibratiale koppeling staat met de gebroken binding. Dit betekent dat de moleculen de vervangingen van de isotopen op een andere manier gebruiken, en deze koppeling kan het verloop van de reactie beïnvloeden. In zulke gevallen kan een secundair kinetisch isotopisch effect een aanwijzing geven voor de aanwezigheid van tussenstappen in de reactie, zoals de vorming van carbeniumionen of radicalen.

Een goed voorbeeld van het primaire kinetische isotopische effect wordt gezien bij methylmalonyl-CoA mutase, een enzym dat betrokken is bij de omzetting van methylmalonyl-CoA naar succinyl-CoA. Dit enzym maakt gebruik van co-enzym B12, dat zich omzet in een radicaal tijdens de katalytische reactie. Wanneer de waterstof in de methylgroep van methylmalonyl-CoA wordt vervangen door deuterium, wordt een sterk kinetisch isotopisch effect waargenomen. Dit suggereert dat de rate-limiting stap van de reactie de abstractie van een waterstofradicaal is, wat de belangrijkste stap in de katalyse wordt. Dit effect wordt gemeten door de ratio van snelheden van de reactie met deuterium versus waterstof (kH/kD), die in dit geval 3.5 bedraagt.

Een ander voorbeeld van het secundaire kinetische isotopische effect is te vinden in de dehydratatie van malaat door fumarase. Fumarase katalyseert de stereospecifieke hydratatie van fumaraat naar malaat in de citroenzuurcyclus. Wanneer isotopen zoals tritium worden gebruikt in de substraten, worden secundaire isotopische effecten waargenomen. Deze effecten wijzen op de aanwezigheid van tussenstappen in de reactie, zoals het gebruik van een carbeniumionintermediair. Deze secundaire effecten bieden waardevolle inzichten in de mechanismen die plaatsvinden tijdens de enzymatische katalyse.

Het begrip van het kinetische isotopische effect helpt niet alleen om de snelheid van bepaalde reacties te begrijpen, maar biedt ook belangrijke aanwijzingen over de mechanistische details van enzymen en de tussenstappen die zich kunnen voordoen. Het kan bijvoorbeeld helpen om de specifieke bindingen die cruciaal zijn voor de snelheid van een reactie te identificeren, evenals om te begrijpen hoe veranderingen in de structuur van een enzym of reactiemolecuul de algehele snelheid van de reactie kunnen beïnvloeden. Dit maakt het een onmisbaar hulpmiddel in zowel fundamenteel onderzoek als toegepaste biochemie.

Naast de primaire en secundaire kinetische isotopische effecten is het ook belangrijk te begrijpen dat isotopische substituties niet altijd even invloedrijk zijn op de reactiesnelheid. Bijvoorbeeld, het vervangen van koolstof-12 (12C) door koolstof-13 (13C) leidt tot een veel kleinere verandering in de massa, en daarom is het kinetische isotopische effect vaak veel minder significant. Dit benadrukt het belang van het kiezen van de juiste isotopen voor het experiment en het nauwkeurig interpreteren van de resultaten, afhankelijk van de specifieke aard van de reactie die wordt bestudeerd.