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Negli ultimi anni, la microscopia a fluorescenza multiphotonica ha fatto passi da gigante, diventando una delle tecnologie più promettenti per l'imaging biologico e neuroscientifico. Grazie alla sua capacità di penetrare in profondità nei tessuti e di visualizzare dettagli cellulari e subcellulari con una risoluzione incredibile, questa tecnologia ha aperto nuove prospettive nell'osservazione di strutture complesse come i neuroni, le connessioni sinaptiche e le attività cerebrali in tempo reale.
Uno degli sviluppi più significativi è stato il miglioramento della microscopia a fluorescenza a due fotoni, resa possibile grazie a fibre fotoniche cristalline a doppio rivestimento. Queste fibre sono state adottate per combinare l'eccitazione e la raccolta dei fotoni, permettendo di ottenere immagini più chiare e dettagliate, specialmente per la generazione di immagini di seconda armonica (SHG). In questo tipo di imaging, i tessuti ricchi di collagene producono un fotone con metà della lunghezza d'onda della luce incidente quando due fotoni della stessa frequenza interagiscono. L'uso di tali fibre è stato pionieristico in numerosi sviluppi, tra cui la microscopia SHG endoscopica, che ha raggiunto risoluzioni assiali inferiori a 1 μm.
I progressi non si sono fermati alla microscopia a due fotoni. La microscopia a tre fotoni, che offre una risposta non lineare più forte, è emersa come una nuova frontiera. Rispetto alla microscopia a due fotoni, la microscopia a tre fotoni consente una maggiore profondità di imaging, riducendo nel contempo i danni e la tossicità fotonica. Questo avanzamento è stato esemplificato da ricerche come quelle condotte dall'Università di Heidelberg, che ha introdotto una tecnica di eccitazione a tre fotoni adattativa sincronizzata con un elettrocardiogramma (ECG), al fine di compensare i movimenti durante le riprese. Inoltre, l'uso di un laser a 1700 nm da parte della Cornell University ha permesso di ottenere immagini più profonde del cervello, superando le limitazioni di risoluzione con una compressione dell'impulso che ha migliorato la qualità delle immagini.
Anche la miniaturizzazione degli strumenti ha giocato un ruolo cruciale nel progresso di queste tecniche. Ad esempio, i ricercatori della Peking University hanno creato un microscopio a due fotoni indossabile che pesa solo 2,15 grammi e che è in grado di rilevare l'attività neuronale in topi liberi di muoversi, migliorando significativamente la velocità di scansione e la risoluzione. Questo tipo di dispositivo è essenziale per studi in vivo, poiché permette l'osservazione in tempo reale di fenomeni neuronali complessi senza limitare il movimento degli animali.
Parallelamente, sono stati sviluppati sistemi di microscopia a fluorescenza a due fotoni senza lenti, impiegando fibre ottiche, per espandere il campo visivo senza compromettere la risoluzione laterale. La capacità di regolare la lunghezza d'onda di eccitazione consente di migliorare ulteriormente la qualità del segnale di fluorescenza e di ottenere immagini più dettagliate.
L'evoluzione della microscopia multiphotonica ha anche avuto un impatto significativo sul campo delle neuroscienze, in particolare per lo studio delle attività cerebrali in vivo. L'utilizzo di sistemi di imaging miniaturizzati, come quello sviluppato dalla Peking University, ha permesso di esplorare il cervello a profondità notevoli, raggiungendo anche 970 μm. Tuttavia, uno dei principali problemi rimane l'equilibrio tra la risoluzione e il campo visivo, che continua a essere un tema centrale nelle ricerche future.
Un altro importante avanzamento riguarda la microscopia a fluorescenza multiphotonica accoppiata con la tecnologia MEMS (microeletromeccanica). I MEMS hanno migliorato la velocità di scansione e contribuito alla miniaturizzazione dei dispositivi, consentendo l'uso di tecniche di imaging in tempo reale. Le tecnologie MEMS, integrate con sistemi di microscopia avanzata, hanno reso possibili dispositivi compatti e altamente efficienti per la visualizzazione di strutture cellulari e per l'imaging neuronale.
L'integrazione di questi dispositivi con tecniche avanzate di eccitazione ottica e l'uso di spettroscopie come quella a supercontinuum, che copre una vasta gamma di lunghezze d'onda, sta migliorando ulteriormente la capacità di analizzare tessuti biologici complessi. Ad esempio, l'uso di algoritmi per selezionare la lunghezza d'onda ottimale per eccitare i fluorofori sta potenziando i segnali di fluorescenza e migliorando la risoluzione complessiva delle immagini.
In sintesi, la microscopia multiphotonica, che comprende le tecnologie a due e tre fotoni, rappresenta un avvento straordinario per le neuroscienze e la biologia cellulare, grazie alla sua capacità di offrire una visione dettagliata dei processi cellulari e neurali. Tuttavia, rimangono sfide importanti, come l'ottimizzazione dell'equilibrio tra risoluzione e campo visivo, e la miniaturizzazione delle apparecchiature per l'uso in vivo. L'evoluzione continua di questi strumenti apre la strada a nuove applicazioni nell'imaging cerebrale, nella neurologia e nella biologia molecolare.
Come la fibra ottica con rivestimento Au-PDMS può migliorare l'imaging ad ultrasuoni
Il processo di realizzazione di sonde ottiche per la generazione di ultrasuoni ha visto negli ultimi anni il miglioramento delle prestazioni, grazie all'utilizzo di compositi innovativi come la fibra multimodale ricoperta di Au-PDMS. Una delle metodologie più efficaci prevede l'immersione della fibra ottica in una soluzione di Au-PDMS, creando un composito che, sotto l'illuminazione con luce a 532 nm, è in grado di generare pressioni ultrasoniche di 0,64 MPa, misurate a 1 mm dalla superficie. Questa performance è accompagnata da una larghezza di banda ultrasonica superiore a 20 MHz, un significativo miglioramento rispetto ai metodi precedenti, come quello descritto da Wu et al. (2012).
Questi risultati non solo mostrano l'efficacia dei compositi Au-PDMS, ma stabiliscono anche la fattibilità dell'imaging ad ultrasuoni in microscopie a scansione ottica (MIS) utilizzando trasmettitori fibre ottiche. L'uso di una sonda ottica Au-PDMS, abbinata a un idrofono, ha permesso di ottenere risoluzioni dell'immagine di 200 μm, dimostrando una registrazione eccellente tra le immagini ad ultrasuoni e le fotografie del campione tissutale. Un esempio di ciò può essere osservato nelle immagini della sezione di tessuto di suino, dove le immagini ad ultrasuoni, ottenute grazie alla sonda, risultano particolarmente nitide e ben definite.
Nonostante queste promettenti prestazioni, l'efficienza di conversione fotoacustica dei compositi Au-PDMS è stata trovata essere cinque ordini di grandezza maggiore rispetto ai tradizionali film metallici di alluminio e tre ordini di grandezza superiore rispetto ai compositi Gr-Ep, ma inferiore di un ordine di grandezza rispetto ai compositi MWCNT-PDMS. Tuttavia, il miglioramento delle prestazioni è stato confermato dalle immagini a risoluzione elevata di tessuti animali ex vivo, una dimostrazione chiave per l'applicazione di questi trasmettitori ottici in contesti biomedici.
In un altro studio, utilizzando un protocollo "one-pot", è stato creato un composito Au-PDMS su fibra multimodale con diametro di 400 μm. Questo composito presentava uno spessore inferiore rispetto a quello fabbricato da Wu et al., ma la tecnica di rivestimento mediante immersione è risultata poco controllabile, portando ad una dissipazione acustica delle frequenze più alte. L'utilizzo di tecniche come la fresatura con fascio di ioni focalizzati (FIB) è stato suggerito come una strategia alternativa per creare compositi con spessori minori, in grado di migliorare ulteriormente le prestazioni ultrasoniche, riducendo l'attenuazione e incrementando la larghezza di banda.
Le strutture micro e nanometriche ottenute tramite FIB hanno mostrato che le strutture regolari di oro presentano valori α superiori rispetto a quelle irregolari, contribuendo così a un miglioramento delle prestazioni ultrasoniche. In uno studio condotto da Tian et al., sono stati fabbricati trasmettitori ultrasonici con materiali a base di nanoparticelle d'oro, riducendo lo spessore complessivo del composito e ottenendo una larghezza di banda di 7 MHz con una pressione del segnale ultrasonico di 2,73 kPa, segno di un miglioramento, anche se lieve, rispetto alle prestazioni ottenute dai metodi precedenti.
L'elettrospinning è un'altra tecnica emergente utilizzata per la creazione di fibre di nanoparticelle carboniose, come quelle dei filamenti di CNF-PDMS. Questo metodo è stato recentemente adottato da Poduval et al., che hanno creato compositi bilayer CNF-PDMS sui terminali di fibre ottiche da 200 μm. La struttura a maglia dei filamenti elettrofilati consente una migliore integrazione con il rivestimento PDMS, migliorando la conducibilità termica e aumentando la generazione di pressioni ultrasoniche. In particolare, i compositi elettrospun con uno spessore ridotto hanno generato larghezze di banda ultrasoniche superiori, raggiungendo i 29 MHz, contro gli 8 MHz dei film dip-coated standard.
I compositi MWCNT-PDMS sono tra i più promettenti per la generazione di ultrasuoni, come dimostrato da studi che evidenziano una produzione di alte pressioni ultrasoniche. Tuttavia, una delle principali sfide nella realizzazione di questi compositi è stata la dispersione stabile di MWCNT in solventi compatibili con il PDMS. Grazie alla funzionalizzazione con ligandi specifici, è stato possibile ottenere una distribuzione uniforme di MWCNT nel PDMS, creando campi ultrasonici omogenei. Le pressioni ultrasoniche generate da questi compositi hanno raggiunto valori superiori rispetto ad altri tipi di fibre ottiche, con larghezze di banda comprese tra i 12 e i 15 MHz.
In generale, la sintesi di compositi avanzati per la generazione di ultrasuoni tramite fibre ottiche ha compiuto progressi significativi, spianando la strada per applicazioni mediche più precise e dettagliate. L'integrazione di materiali come Au-PDMS, CNF e MWCNT all'interno di fibre ottiche rappresenta un passo fondamentale per ottenere immagini ad alta risoluzione, in grado di rispondere alle crescenti esigenze in ambito diagnostico e terapeutico.