Come Ottimizzare l'Efficienza della Quantificazione del DNA con Particelle d'Oro: Tecniche e Approfondimenti

L'efficienza tra Target-cDNA e le sonde Pr1/Pr4 può essere migliorata in modo significativo quando il Target-cDNA viene immobilizzato su nanoparticelle d'oro (AuNP) attraverso ibridazione con le sonde Pr2/Pr3. Le immagini ottenute tramite la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) delle particelle recuperate dalle diverse bande del gel di elettroforesi mostrano una separazione completa tra monomeri, dimeri e trimeri. Questo conferma la uniformità nelle dimensioni e nelle modifiche superficiali delle AuNPs. L'analisi delle sospensioni di monomeri, dimeri e trimeri tramite Cryo-TEM ha rivelato che la distanza interparticellare tra i dimetri e i trimeri è costantemente di 13 nm, che corrisponde alla lunghezza della sonda Pr3. Una distanza così ampia non provoca un cambiamento spettrale nell'assorbimento di Plasmoni Superficiali Localizzati (LSPR) a causa dell'interazione tra le particelle, confermando l'assenza di legami non specifici.

Per approfondire la comprensione della relazione tra le particelle d'oro e il DNA bersaglio, sono state effettuate misurazioni di assorbimento che hanno mostrato che le spettri di AuNPs non modificate, AuNPs con Pr2, Pr3, e sospensioni di monomeri, dimeri e trimeri sono sostanzialmente sovrapposti. Questo suggerisce che le modifiche superficiali non alterano significativamente il comportamento ottico delle AuNPs, un aspetto cruciale per il monitoraggio della stabilità del sistema.

Ulteriori conferme sulla distribuzione delle dimensioni e sulla stabilità delle sospensioni sono state ottenute tramite la misurazione della distribuzione dinamica della luce (DLS). Le dimensioni medie di AuNPs non modificate e di AuNPs modificati con Pr2 e Pr3, insieme ai monomeri, dimeri e trimeri, sono state misurate, mostrando che i monomeri e i dimeri hanno dimensioni simili e una leggera variazione rispetto alle AuNPs originali non modificate.

Nel contesto di una diagnosi quantitativa, è stato utilizzato il metodo di elettroforesi per separare i dimetri, i trimeri e tetrameri di Target-cDNA a concentrazioni che vanno da 0,6 a 5000 pM. La quantità di ogni multimerico è stata analizzata con il software NIH ImageJ per tracciare l'intensità integrata di ciascuna banda. Da queste misurazioni, è stata costruita una curva di calibrazione che mostra un buon adattamento ai dati attraverso una legge del potere, con un coefficiente di determinazione R² pari a 0,9887.

Un limite della tecnologia è rappresentato dalla formazione di aggregati a concentrazioni di Target-cDNA superiori a 156 pM, dove si formano multimere superiori ai tetrameri, comportando una deviazione dalla legge del potere e una riduzione della risoluzione della separazione elettroforetica. Tuttavia, è stato possibile determinare una sensibilità fino a 1 pM per la rilevazione del DNA bersaglio, come mostrato dall'analisi delle bande elettroforetiche.

In seguito a questi risultati, si è cercato di estendere il range dinamico della rilevazione del DNA bersaglio, variando la dimensione e la concentrazione delle AuNPs, oltre alla densità delle sonde superficiali. L'efficienza di dimerizzazione delle AuNPs è aumentata ottimizzando la ibridazione tra le sonde Pr3 e Pr2 con il DNA bersaglio complementare, consentendo di raggiungere una sensibilità sub-pM nelle concentrazioni più basse.

Il protocollo per la formazione di dimetri di AuNPs è stato migliorato con l'introduzione di un processo di immobilizzazione, coniugazione e ibridazione, in cui due aliquoti di dispersione di AuNP sono stati coniugati separatamente con due sonde diverse (Pr2-AuNP e Pr3-AuNP). La densità di sonde ssDNA è stata attentamente regolata in base alla dimensione delle nanoparticelle per garantire una corretta formazione dei dimetri. Questo approccio ha permesso una migliore definizione dei limiti di quantificazione per concentrazioni di DNA bersaglio che vanno da 0,6 pM fino a 20.000 pM.

Nel complesso, questo approccio offre una base solida per applicazioni diagnostiche avanzate, ma è necessario tenere in considerazione alcuni fattori critici, come l'ottimizzazione delle condizioni di ibridazione, la gestione della stabilità delle particelle e l'accuratezza delle misurazioni elettroforetiche. Le future applicazioni potrebbero beneficiare dell'integrazione di tecniche complementari per superare i limiti di risoluzione e ampliare il range dinamico di rilevamento.

Come la Spettroscopia Elettronica Bidimensionale (2DES) Riveli la Struttura Elettronica delle Molecole di Squaraina

La spettroscopia elettronica bidimensionale (2DES) è uno strumento avanzato che consente di esplorare in modo approfondito le dinamiche degli stati eccitati di una molecola, rivelando dettagli sulla sua struttura elettronica. Nel caso delle molecole di squaraina, una classe di composti organici promettenti nel campo dei semiconduttori, l'analisi 2DES è fondamentale per comprendere i processi di transizione elettronica e vibrazionale che avvengono durante l’eccitazione.

Nell’esperimento condotto su molecole di squaraina in soluzione, è stato possibile osservare gli spettri differenziali dipendenti dall'energia di eccitazione e di rilevamento, a seconda del tempo di attesa. I risultati mostrano chiaramente un picco diagonale dominante intorno a 1.9 eV, corrispondente alla transizione elettronica dal livello fondamentale |g〉 al livello eccitato |c〉. A questo picco centrale si aggiungono altri picchi di intersezione (cross-peaks) a circa 2.1 eV, visibili lungo le assi di eccitazione e rilevamento.

L'intensità del segnale nei diagrammi 2DES è positiva, il che implica che il segnale è governato dalla band di bleeching e dalla stimolazione dell'emissione (SE) della transizione |g〉 → |c〉, mentre i contributi dall'assorbimento dello stato eccitato sono meno significativi. Un aspetto interessante che emerge da questi esperimenti è l’effetto delle vibrazioni a bassa frequenza, che distorcono il picco diagonale in modo evidente, soprattutto nei primi tempi di attesa, come illustrato nei grafici (Figura 5.4a, b).

Le modalità vibrazionali a frequenze elevate (~180 meV), che corrispondono a vibrazioni rapide (~22 fs), sono ben risolte nei diagrammi 2DES, dato che l’energia associata a queste vibrazioni è maggiore della larghezza della linea spettrale. Tuttavia, l'accoppiamento con vibrazioni a frequenza più bassa produce distorsioni periodiche nella forma dello spettro 2DES in funzione del tempo di attesa. Queste distorsioni sono più difficili da analizzare quantitativamente, poiché diverse modalità contribuiscono a questo fenomeno.

Per quanto riguarda il comportamento vibronico nelle molecole di squaraina in soluzione, è stato utilizzato un metodo di spettroscopia vibrazionale temporale ad impulsi ultracorti (sotto i 10 fs), sintonizzati sulla transizione |g〉 → |c〉. Questo approccio ha permesso di osservare come l'eccitazione ottica coerente crea un pacchetto d'onda vibrazionale nella regione di Franck-Condon, sulla superficie di energia potenziale dello stato eccitato.

Il pacchetto d'onda, inizialmente creato nella regione di Franck-Condon, oscilla periodicamente attorno al minimo della superficie di energia potenziale dello stato eccitato. Queste oscillazioni, con un periodo che dipende dalla frequenza delle modalità vibrazionali, modulano la trasmissione di un secondo impulso ultracorto, il quale traccia direttamente il movimento di questo pacchetto d'onda nel dominio del tempo.

La spettroscopia a pump-probe dei composti di squaraina ha rivelato una serie di caratteristiche distintive. In particolare, i segnali di emissione stimolata (SE) e di bleeching della transizione |g〉 → |c〉 appaiono nettamente a circa 1.9 eV, con spalle deboli a circa 1.75 e 2.1 eV. Durante i tempi di attesa positivi, sono state osservate oscillazioni periodiche nel segnale, associate a periodi di vibrazione distinti, con due modalità dominanti a 147 cm⁻¹ (227 fs) e 570 cm⁻¹ (58 fs). Tali oscillazioni si manifestano come distorsioni periodiche nei diagrammi spettrali, evidenziando il comportamento vibronico delle molecole.

Un aspetto centrale di questa ricerca è la comprensione di come i movimenti coerenti del pacchetto d'onda eccitato modifichino l'energia della transizione tra lo stato fondamentale e lo stato eccitato. L'eccitazione impulsiva lancia il pacchetto d'onda in una regione di energia potenziale eccitata, con una differenza energetica massima, che poi oscilla, influenzando la transizione energetica e introducendo una modulazione periodica nel segnale spettrale.

Dalla trasformata di Fourier dei segnali residui, sono stati identificati due picchi dominanti nelle frequenze vibrazionali. L'analisi ha permesso di stimare il tempo di rilassamento vibrazionale delle modalità a bassa frequenza (350 fs) e ad alta frequenza (1.5 ps). Le modalità ad alta frequenza, pur essendo visibili come oscillazioni di breve durata nel dominio del tempo, non sono abbastanza forti da produrre picchi evidenti nei diagrammi di Fourier.

L’analisi dettagliata di queste modalità vibroniche è cruciale per comprendere i processi di accoppiamento vibronico all'interno delle molecole di squaraina, particolarmente per migliorare la progettazione di dispositivi ottico-elettronici a base di semiconduttori organici. La capacità di manipolare e controllare questi accoppiamenti vibronici offre enormi potenzialità per l'ottimizzazione delle proprietà elettroniche e fotoniche dei materiali organici.

In sintesi, l’approfondimento delle dinamiche vibroniche ed elettroniche delle molecole di squaraina tramite spettroscopia 2DES e spettroscopia temporale ad impulsi ultracorti permette di estrarre informazioni fondamentali sulla struttura elettronica e sugli accoppiamenti vibronici di queste molecole. Questi studi sono cruciali per sviluppare dispositivi con migliori prestazioni, sfruttando appieno le proprietà di accoppiamento tra stati eccitati e vibrazioni, un aspetto chiave nell’ottimizzazione dei semiconduttori organici.

Come le Aggregazioni di Molecole Influiscono sulla Spettroscopia Elettronica a Due Dimensioni: Approfondimenti sui Modelli Frenkel e la Larghezza Inomogenea

Il comportamento di aggregati molecolari come le catene disordinate di monomeri, modelli comunemente descritti dalla Hamiltoniana degli eccitoni di Frenkel, dimostra che l'interazione tra accoppiamenti elettronici e disordine induce una delocalizzazione degli stati eccitonici su più monomeri. In presenza di disordine, la lunghezza di coerenza dell'eccitone, Nc, si riduce, limitando l'estensione degli stati eccitonici. Questo fenomeno, ben documentato per i J-aggregati, determina una maggiore disomogeneità e una risposta spettrale più complessa. Per un singolo stato eccitonico, i picchi nel diagramma 2DES appaiono come forme a stella, con larghezze di linea determinate dal tasso di de-fase elettronico.

Nell'ambito di un modello semplificato, la distribuzione spettrale degli eccitoni è descritta come una somma di contributi di singoli stati eccitonici, ma la presenza di accoppiamenti elettronici tra i vari monomeri crea una ripulsione di livelli che porta al fenomeno della non-linearità ottica. La transizione tra uno stato eccitonico a uno stato due-eccitoni provoca un "blue shift" dell'assorbimento, spostando l'energia di eccitazione a valori più elevati. Per esempio, nei campioni di squaraine, la misurazione del shift due-eccitoni (ΔE) mostra uno spostamento di circa 3 meV, confermando la non-linearità ottica del sistema.

Inoltre, l'uso della spettroscopia 2DES con un interferometro TWINS consente di misurare la risposta spettrale in diverse condizioni di aggregazione. La possibilità di variare i parametri come il tempo di de-fase e l'energia di eccitazione permette una comprensione più profonda della dinamica dei singoli stati eccitonici e delle interazioni tra monomeri. Le simulazioni numeriche basate sul modello di Frenkel forniscono una comprensione quantitativa di come il disordine e l'accoppiamento elettronico influenzino le proprietà spettrali, consentendo di ottenere un buon accordo con i dati sperimentali.

È importante comprendere che, pur essendo il modello di Frenkel efficace per descrivere aggregati di piccole dimensioni e disordinati, esso potrebbe non essere completamente applicabile in sistemi di dimensioni più grandi o in presenza di altre forme di disordine, come la variabilità nelle interazioni molecolari a lunga distanza o gli effetti di polarizzazione. L'effetto del disordine, in particolare, può variare in modo significativo in funzione del materiale di supporto, come nel caso dei campioni su vetro rispetto a quelli su film d'oro, mostrando come la superficie del substrato possa influire sulla qualità e sulla struttura dell'aggregato molecolare.