Antibiotikaresistenzen in Bakterien können grundsätzlich in zwei Kategorien unterteilt werden: in natürliche (intrinsische) und erworbene Resistenzen. Eine weitere Form der Resistenz, die gelegentlich erwähnt wird, ist die adaptive Resistenz, die in manchen Fällen als Teil der intrinsischen Resistenz betrachtet werden kann.

Intrinsische Resistenz bezeichnet die natürliche Unempfindlichkeit einiger Bakterien gegenüber bestimmten Antibiotika, die aus strukturellen oder funktionellen Eigenschaften resultiert. Diese Resistenz besteht ohne vorherige Exposition gegenüber den Antibiotika. Ein Beispiel dafür ist die Resistenz von gramnegativen Bakterien gegenüber Vancomycin. Das Molekül ist zu groß, um die äußere Membran dieser Bakterien zu durchdringen. Auch aerobe Bakterien sind gegenüber Metronidazol resistent, da dieses Antibiotikum ein anaerobes Umfeld benötigt, um in seine aktive Form überführt zu werden. Solche und weitere Beispiele werden später für jedes einzelne Antibiotikum detaillierter behandelt.

Erworbene Resistenz hingegen tritt auf, wenn in einer Population von antibiotikaempfindlichen Bakterien einige Zellen die Fähigkeit erwerben, resistent gegenüber einem Antibiotikum zu werden. Diese Resistenz ist also nicht in allen Zellen einer bestimmten Bakterienart vorhanden, sondern nur in einer Teilpopulation. Die Entwicklung erworbener Resistenzen kann auf zwei Wegen erfolgen: durch Punktmutationen und durch den Erwerb von Resistenzgenen.

Adaptive Resistenz beschreibt ein Phänomen, bei dem Bakterien als Reaktion auf bestimmte Umweltbedingungen vorübergehend eine andere Wachstumsform annehmen, die sie resistenter gegenüber Antibiotika macht. Ein Beispiel hierfür sind sogenannte Persistenzbakterien und Bakterien, die in Biofilmen wachsen. Diese Bakterien sind aufgrund ihres langsamen Wachstums oder ihres Ruhezustands gegenüber Antibiotika resistenter. Zu einem späteren Zeitpunkt können sie wieder zu ihrer normalen Wachstumsform zurückkehren. Diese Fähigkeit zur Umstellung auf unterschiedliche Wachstumsformen ist in den Bakterien verankert und kann als Teil der intrinsischen Resistenz betrachtet werden.

Entwicklung von Resistenzen durch Punktmutationen

Punktmutationen können auf zwei Arten entstehen: durch natürliche Prozesse oder durch induzierte Methoden. Bei den natürlichen Methoden entstehen Punktmutationen häufig als Fehler bei der DNA-Replikation. Bakterien haben eine sehr kurze Generationszeit, was bedeutet, dass sie sich rasch vermehren und damit eine hohe Zahl von Mutationen in ihrer Population entstehen kann. Vor jeder Zellteilung muss das chromosomale DNA-Material verdoppelt werden, und dieser Prozess wird durch das Enzym DNA-Polymerase III katalysiert. Die Geschwindigkeit der DNA-Replikation ist extrem hoch, etwa 1000 Basen pro Sekunde. Dies führt zu Fehlern bei der Replikation, die jedoch durch eine „Proofreading“-Funktion der DNA-Polymerase größtenteils korrigiert werden. Trotz dieser Korrekturen bleibt ein gewisser Fehleranteil bestehen. So kommt es mit einer Wahrscheinlichkeit von etwa 1 in 10^9 bei jeder Zellteilung zu einer Mutation.

Obwohl dieser Fehleranteil gering erscheint, führt die hohe Anzahl an Bakterien in einer Infektion dazu, dass in einer Population von etwa 100 Millionen Bakterien mehrere Tausend Mutanten vorhanden sein können. Diese Mutationen verteilen sich zufällig auf die Gene, wobei die Mutationen in „Hauskeeping“-Genen, die für essentielle Funktionen notwendig sind, weniger toleriert werden als in anderen Genen.

Induzierte Punktmutationen können durch extreme Umweltbedingungen wie ionisierende Strahlung oder chemische Substanzen wie Oxidantien oder Alkylierungsmittel entstehen. In einer Wirtsperson sind solche extremen Bedingungen jedoch nicht typisch. Es hat sich jedoch gezeigt, dass der Einsatz von Antibiotika in subletalen Konzentrationen ebenfalls zur Bildung von Punktmutationen führen kann. Diese subletal wirksamen Konzentrationen von Antibiotika verursachen die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, die wiederum Mutationen im bakteriellen Genom hervorrufen können.

Auswirkungen von Punktmutationen

Die meisten Mutationen führen zu einer Veränderung der Proteinsequenz, was wiederum die Aktivität des Proteins beeinflussen kann. Veränderungen im aktiven Zentrum eines Enzyms können die Enzymaktivität erheblich beeinflussen, während Mutationen in anderen Bereichen des Enzyms weniger oder keine Auswirkungen haben. Mutationen können jedoch auch zu einem Funktionszuwachs führen. Eine solche Mutation könnte den Bakterien einen Überlebensvorteil verschaffen, indem sie resistent gegenüber einem bestimmten Antibiotikum wird.

Selektion von Resistenz

In Abwesenheit von Antibiotika wachsen mutierte und wilde Bakterienarten mit gleicher Geschwindigkeit, da sie um Nährstoffe konkurrieren. Sobald jedoch Antibiotika hinzugefügt werden, wächst nur die Population der resistenten Bakterien schnell, während alle anderen entweder absterben oder langsamer wachsen. Zu Beginn mag nur eine einzelne mutierte Zelle in einer Population von Millionen vorhanden sein, doch mit der Zeit kann die gesamte Population aus antibiotikaresistenten Zellen bestehen. Dieser Prozess wird als Selektion bezeichnet. Wichtig dabei ist, dass die Selektion nur dann stattfindet, wenn die Konzentration des Antibiotikums genau der Konzentration entspricht, gegen die das mutierte Bakterium resistent ist. Ein zu hoher Antibiotikaspiegel könnte dazu führen, dass alle Bakterien, auch die resistenten, absterben.

Um die Wirksamkeit eines Antibiotikums zu überprüfen, wird die sogenannte minimale Hemmkonzentration (MHK) bestimmt. Diese gibt an, welche minimale Menge eines Antibiotikums erforderlich ist, um das Wachstum der Bakterien zu stoppen. Wenn die vom Arzt verschriebene Dosis zu niedrig ist, kann es sein, dass die resistenten Bakterien überleben und sich weiterhin vermehren, was zu einem falschen Eindruck von Heilung führt.

Endtext

Warum entwickeln Bakterien Resistenzen gegen Vancomycin und was bedeutet das für die Therapie?

Die Bindung von Vancomycin an das Zellwandmonomer erfolgt durch fünf Wasserstoffbrücken zwischen den Carbonyl- und N-H-Gruppen der Peptidbindungen in Vancomycin und den N-H- und Carbonylgruppen der D-Lys- und D-Ala-Reste sowie der freien Carboxylgruppe des terminalen D-Ala des Monomeren (Abb. 3.28a). Wird jedoch ein D-Ala durch D-Lac im Monomer ersetzt, geht eine der Wasserstoffbrücken verloren. Diese Veränderung wird zusätzlich dadurch verstärkt, dass die Wasserstoffbrücke durch eine abstoßende Wechselwirkung zwischen zwei elektronegativen Sauerstoffatomen ersetzt wird (Abb. 3.28b). Dies reduziert die Bindung von Vancomycin an das Zellwandmonomer erheblich und führt zur Resistenz gegenüber dem Antibiotikum. Diese Erklärung zeigt, warum bestimmte Bakterien eine intrinsische Resistenz gegen Vancomycin aufweisen.

Obwohl diese Bakterien keine Krankheiten beim Menschen verursachen, hat ihre intrinsische Resistenz keinen direkten Einfluss auf die Wirksamkeit von Vancomycin bei menschlichen Erkrankungen. Indirekt jedoch begünstigt die Übertragung von Resistenzgenen durch Konjugation, Transformation oder Transduktion die Entwicklung von Resistenzen bei pathogenen Bakterien, die den Menschen betreffen (Abschnitt 2.6). Der Mechanismus der Vancomycin-Resistenz basiert auf der Synthese eines alternativen Substrats durch verschiedene Gencluster, bekannt als Operons, die für die Resistenz verantwortlich sind. Zu den bekanntesten dieser Cluster gehören VanA, VanB, VanC, VanD, VanE, VanG und VanL [91]. Von diesen ist der VanA-Typ der am häufigsten vorkommende und am meisten untersuchte.

Das VanA-Resistenzgencluster befindet sich auf dem Transposon Tn1546, das 10.581 Basenpaare groß ist und neun Gene umfasst, die in einem Plasmid vorhanden sind. Zwei dieser Gene sind für die Transpositionsfunktion verantwortlich, während die übrigen sieben Gene (vanR, vanS, vanH, vanA, vanX, vanY und vanZ) für die Resistenz gegen Vancomycin und ähnliche Antibiotika verantwortlich sind (Abb. 3.29). Das am wichtigsten für die Resistenz ist das VanA-Protein, das eine D-Ala-D-Lac-Ligase codiert, die D-Ala mit D-Lac verknüpft und somit ein Depsipeptid bildet. Diese Ligase ist sequenziell ähnlich zur üblichen D-Ala-D-Ala-Ligase, jedoch verknüpft sie speziell D-Ala mit D-Lac.

Die Funktion der anderen Gene im VanA-Cluster ist wie folgt: Die VanR- und VanS-Proteine bilden ein zweiseitiges regulatorisches System, das die Transkription der Gene vanHAXYZ reguliert. Ein typisches zweiseitiges regulatorisches System umfasst ein Transmembranrezeptorprotein, das auf ein Umweltzeichen wie das Vorhandensein von Vancomycin anspricht. Dieses Rezeptorprotein sendet das Signal an ein Antwortregulatorprotein auf der zytoplasmatischen Seite der Membran, das dann die Expression spezifischer Gene zur Reaktion auf das Signal aktiviert. In diesem Fall fungiert VanS als Rezeptorprotein für Vancomycin. Es handelt sich um eine Histidinkinase, die beim Nachweis von Vancomycin in der Umgebung ein Histidinrest in ihrer Sequenz autophosphoryliert. Die Phosphorylgruppe wird dann auf das Antwortregulatorprotein VanR übertragen, das dann an die DNA bindet und die Synthese der von vanHAXYZ kodierten Proteine aktiviert.

VanA allein kann jedoch keine Resistenz gegen Vancomycin vermitteln, da D-Lac normalerweise nicht von Enterokokken produziert wird. VanH, ein Lactatdehydrogenase-Enzym, ist dafür verantwortlich, D-Lac aus Pyruvat zu produzieren. Auch wenn diese Resistenzgene vorhanden sind, wird das normale Zellwandmonomer mit der D-Ala-D-Ala-Bindung weiterhin produziert. Um zu verhindern, dass diese normalen Substrate die Resistenz beeinträchtigen, enthält das VanA-Cluster zwei weitere Gene, vanX und vanY. VanX ist eine D-Ala-D-Ala-Dipeptidase, die jedes D-Ala-D-Ala-Dipeptid hydrolysiert, das möglicherweise noch vorhanden ist. VanY ist eine D-D-Carboxypeptidase, die die D-Ala-D-Ala-Bindung in Monomeren hydrolysiert, bevor VanX das D-Ala-D-Ala-Dipeptid abbauen kann. Diese vier Enzyme, VanH, VanA, VanX und VanY, synthetisieren somit ein alternatives Depsipeptid-Substrat, das nicht mit Vancomycin binden kann (Abb. 3.29). Die Funktion von VanZ ist noch nicht bekannt. Sie ist nicht erforderlich für die Resistenz gegenüber Vancomycin, könnte jedoch eine Rolle bei der Resistenz gegenüber Teicoplanin spielen, da sie die minimal inhibierende Konzentration von Teicoplanin mäßig erhöht [81].

Neben dem VanA-Typ gibt es auch Berichte über andere Vancomycin-Resistenzen wie den VanB-, VanC-, VanD-, VanE-, VanG- und VanL-Typ. Diese Typen weisen signifikante Sequenzähnlichkeiten zum VanA-Typ auf, unterscheiden sich jedoch in einigen Aspekten, insbesondere in der Art der Gentransferbarkeit. Einige dieser Cluster sind plasmidgetragen und können leicht durch Konjugation auf andere Bakterien übertragen werden, während andere in Chromosomen vorhanden sind und somit weniger leicht übertragen werden können. Sie differieren auch in den Expressionsniveaus der Gene. Einige Cluster sind nur induzierbar in Gegenwart von Vancomycin, während andere konstitutiv exprimiert werden. Darüber hinaus kann das alternative Monomer-Substrat für einige Resistenztpyen eine D-Ala-D-Serin-Bindung (VanC, E, G und L) anstelle einer D-Ala-D-Lac-Bindung (VanA, B und D) aufweisen [93].

Ein weiteres interessantes Phänomen im Zusammenhang mit Vancomycin ist die Entstehung von vancomycinabhängigen Bakterien. Diese Bakterien sind nicht nur gegen Vancomycin resistent, sondern benötigen es tatsächlich für ihr Wachstum. Diese Bakterien stellen eine ernsthafte Gefahr dar, da sie ohne Vancomycin nicht wachsen können und daher unter normalen Wachstumsbedingungen nicht nachgewiesen oder kultiviert werden können. Die erste Entdeckung eines vancomycinabhängigen Enterokokken wurde 1994 berichtet [94], und es folgten zahlreiche weitere Berichte [95-97].

Vancomycinabhängige Bakterien sind in Wirklichkeit vancomycinresistente Bakterien, die Mutationen entwickelt haben, die das normale D-Ala-D-Ala-Ligase-Gen inaktivieren. Dadurch können sie keine Zellwand mehr mit den normalen Genen herstellen und können unter normalen Bedingungen nicht wachsen. In Anwesenheit von Vancomycin werden jedoch die Vancomycin-Resistenzgene exprimiert, was es den Bakterien ermöglicht, mit der D-Ala-D-Lactat-Ligase eine Zellwand zu synthetisieren, wie bereits beschrieben. Es gibt auch die Möglichkeit einer Umkehrung zum vancomycinunabhängigen Phänotyp, indem entweder eine Mutation die Wirkung der ursprünglichen Mutation negiert oder die Expression der Resistenzgene konstitutiv wird.

Wie die Wasserstoffbrückenbindung und die Superhelikalstruktur der DNA ihre Funktionalität bestimmen

Die fünf Basen der DNA sind in der Lage, an Wasserstoffbrückenbindungen teilzunehmen, entweder als Donor oder als Akzeptor. Abbildung 5.2 veranschaulicht, wie diese Bindungen an den drei entsprechenden Positionen der vier Basen der DNA gebildet werden können. Die Pfeile zeigen von den Wasserstoffbrückendonoren (immer ein Wasserstoff, der kovalent an Stickstoff, Sauerstoff oder Fluor gebunden ist) und zu den Akzeptoren (irgendwelche der drei elektronegativen Atome Stickstoff, Sauerstoff oder Fluor). Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) können drei Wasserstoffbrücken bilden, während Adenin (A) nur zwei Wasserstoffbrücken ausbilden kann. Es ist zu beachten, dass weitere Wasserstoffbrücken mit Wasser gebildet werden können, wenn die freien Nukleotide in Wasser gelöst sind.

Die DNA ist doppelsträngig, und die beiden Stränge interagieren durch Wasserstoffbrückenbindungen. In der doppelsträngigen DNA paart sich G stets mit C und A mit T. Um Basenpaare zu bilden, müssen die Donorpfeile neben den Akzeptorpfeilen positioniert sein. Obwohl T in der Lage ist, drei Wasserstoffbrücken zu bilden, kann es nicht mit G oder C paaren, da die Positionen der Donoren und Akzeptoren nicht übereinstimmen. Ebenso kann T nur zwei Wasserstoffbrücken mit A bilden, da hier die Donor- und Akzeptorpositionen passen. Da G mit C und A mit T paart, ist der Prozentsatz von G gleich dem von C und der von A gleich dem von T.

Die Biochemie der DNA umfasst nicht nur diese Wasserstoffbrückenbindungen, sondern auch die Art und Weise, wie sich die Nukleotide im Strang anordnen. In einem Nucleosidmonophosphat ist die 5′-CH2-P-Gruppe senkrecht zum Ribosering angeordnet, und die Base ist ebenfalls senkrecht zum Ribosering positioniert. In einem Einzelstrang der DNA sind die Nukleotide durch Phosphoesterbindungen zwischen der 3′-OH-Gruppe eines Nukleotids und der 5′-CH2-P-Gruppe des anderen verbunden. Das Rückgrat eines DNA-Stranges besteht also aus den Phosphorylgruppen sowie den Kohlenstoffatomen der 5′-, 4′-, 3′-Positionen und dem Sauerstoffatom des 3′-Endes. Alle Nukleotide innerhalb eines Strangs haben dieselbe Orientierung, was der DNA eine Richtung verleiht. Das Ende mit dem freien Phosphat an C5′ wird als 5′-Ende bezeichnet, während das Ende mit dem freien Hydroxyl (OH) an C3′ als 3′-Ende bekannt ist. Die Sequenz eines Stranges wird nach der Konvention immer in der 5′-3′-Richtung abgelesen.

Wenn die beiden Stränge als doppelsträngig dargestellt werden, ist einer der Stränge in der 5′-3′-Richtung und der andere in der 3′-5′-Richtung orientiert. Die Stränge sind komplementär zueinander und werden durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basenpaaren (A=T oder G≡C) zusammengehalten. In der doppelsträngigen DNA beträgt der Abstand zwischen den beiden Zucker-Phosphat-Rückgraten bei jedem Basenpaar (1 Purin + 1 Pyrimidin) gleich. Dadurch haben alle DNA-Moleküle trotz ihrer unterschiedlichen Sequenzen die gleiche regelmäßige Struktur. Aufgrund der Wasserstoffbrücken und des gleichbleibenden Abstands zwischen den Rückgraten hat die Struktur die Form einer Leiter, wobei die Basen senkrecht zur Längsachse der „Leiter“ ausgerichtet sind.

Es ist jedoch zu beachten, dass die tatsächliche Struktur der doppelsträngigen DNA, wie sie von Watson und Crick beschrieben wurde, nicht wie eine Leiter ist. Die beiden Stränge wickeln sich um einander, um eine doppelsträngige helikale Struktur zu bilden. Die doppelsträngige Helix bildet sich, weil die Leiter in einem Winkel verdreht wird, sodass in jeder Umdrehung der Helix etwa 10 (genauer 10,4) Nukleotide pro Strang untergebracht sind. Warum aber bildet die DNA eine helikale Struktur? Allein die Basenpaarung erklärt nicht die Bildung dieser Struktur. In Wirklichkeit sind es nicht die Wasserstoffbrücken, die die doppelsträngige DNA stabilisieren. Der wahre Grund für die helikale Struktur liegt in der hydrophoben Wechselwirkung, die zwischen den benachbarten Basenpaaren auftritt. Diese Wechselwirkung schließt Wasser aus dem Inneren der DNA-Doppelhelix aus und sorgt für eine stabile Anordnung der Basenpaare übereinander. Dieser Vorgang wird als „Stacking-Interaktion“ bezeichnet. Durch die helikale Form wird der vertikale Abstand für die gleiche Länge der kovalenten Bindungen zwischen den Nukleotiden verringert, sodass die Basenpaare aufeinander gestapelt werden können.

Die Stabilität der doppelsträngigen DNA wird durch diese Stacking-Interaktionen zwischen den Basenpaaren maßgeblich bestimmt. Das Innere der Helix ist dadurch sehr hydrophob, was bedeutet, dass Wasserstoffbrückenbindungen stabil bleiben, da keine Wasser-Moleküle das Innere der Helix betreten können. Außerdem hat die Helix zwei Rillen unterschiedlicher Größe, die durch die Art und Weise entstehen, wie die Basenpaare gestapelt sind und die Rückgrate gewunden sind. Diese werden als die große Rille und die kleine Rille bezeichnet. Der thermodynamische Vorteil der Helixstruktur ist so groß, dass die DNA automatisch eine helikale Struktur bildet, ohne dass Enzyme oder zusätzliche Energie notwendig sind. Die Entwindung und Trennung der komplementären Stränge wird als „Denaturierung“ bezeichnet und erfordert zusätzliche Energie. Diese vollständige Denaturierung kann nur in vitro erfolgen. In vivo gibt es jedoch eine lokale Denaturierung, die in kurzen Abschnitten der DNA auftritt. Dieser Prozess benötigt Energie aus ATP und wird durch das Enzym DNA-Helikase katalysiert. Diese lokale Denaturierung ist für die Prozesse der Replikation, Transkription und konjugativen Transfer unerlässlich.

In Bezug auf die Struktur der DNA spielt auch das Konzept der Superhelikalität eine wichtige Rolle. Die Superhelikalität beschreibt eine zusätzliche Windung der DNA-Stränge, die durch die Belastung der DNA-Moleküle entstehen kann. In entspannter, ungespannter doppelsträngiger DNA gibt es etwa zehn Basenpaare pro Umdrehung der Helix. Wenn diese DNA jedoch weiter verdreht wird, erhöht oder verringert sich die Anzahl der Basenpaare pro Umdrehung. Dieser Zustand führt zu einer erhöhten Spannung, die in der Zelle durch verschiedene Mechanismen entlastet werden kann. Ein solcher Mechanismus ist die Supercoiling der DNA. Supercoils können zwei Formen annehmen: positive Supercoils, bei denen die Windung in die gleiche Richtung wie die Helix erfolgt, und negative Supercoils, bei denen die Windung in die entgegengesetzte Richtung erfolgt.

Ein weiteres Beispiel für die Superhelikalität ist die DNS von E. coli, die durch das Supercoiling ihre Struktur stark komprimiert, sodass die gesamte Länge der Chromosomen nur einen Bruchteil des Zellvolumens einnimmt. Wenn die DNA denaturiert werden muss, muss zunächst der Verknüpfungsgrad wieder auf den normalen Wert von etwa 10,4 Basen pro Umdrehung gebracht werden, bevor die beiden Stränge durch den Bruch der Wasserstoffbrücken voneinander getrennt werden können.

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