Hvad er de grundlæggende udfordringer ved kalibrering i analytisk kemi?

I praksis kan der opstå mange problemer, når man forsøger at følge de etablerede principper for kalibrering i analytisk kemi. Instrumentelle udsving, som driftsændringer, trykvariationer (i kromatografi), temperaturændringer i kilden, osv., kan kompenseres for ved hjælp af intern standardmetode. Denne metode indebærer, at man tilføjer et ekstra stof, en intern standard, som er forskellig fra analytten, til alle de løsninger, der skal måles. For hver løsning beregnes forholdet mellem signalerne for analytten og den interne standard, og dette forhold plottes mod koncentrationen af analytten. Den interne standard skal opfylde flere væsentlige krav, hvor de vigtigste er: 1) den skal have en lignende fysisk og kemisk adfærd i måleapparatet som analytten, 2) koncentrationsområdet skal være sammenligneligt med analyttens, 3) den må ikke være til stede i testprøverne eller i kalibreringsstandarderne.

En af de største udfordringer er, at det er svært at matche matrixen af de arbejdsprøver, der opnås ved behandling af prøverne, med matrixen i standardløsningerne, som bruges til at kalibrere instrumentet. Det betyder, at det kan være problematisk at acceptere, at adfærden af standarderne og prøverne er identisk. Hvis det ikke er tilfældet, kan det føre til spørgsmål vedrørende validiteten af hele kalibreringen. Der er ikke plads til at dække alle de problemer, der kan opstå under standardisering (kalibrering), men en almindelig anvendt metode er Standard Addition Method, som for nylig blev gennemgået i litteraturen.

Der er dog flere matematiske krav, der skal være opfyldt for korrekt at anvende mindste kvadrater-metoden. For det første skal de eksperimentelle fejl akkumuleres i signalområdet, hvilket betyder, at fejlene i x-værdierne er enten ubetydelige eller kan negligeres i forhold til fejlene i y-værdierne. Dette kan dog være problematisk i sporstoffanalyse og ultratraceanalyse. For det andet skal fejlene i signalerne følge en Gaussisk fordeling, hvilket normalt er acceptabelt, hvis instrumentet er stabilt og under statistisk kontrol. Endelig skal fejlene i signalerne være uafhængige af størrelsen på x-værdierne – en tilstand, der kaldes homoskedasticitet. Hvis signalfejlene er afhængige af x-værdierne, kaldes det heteroskedasticitet, og det er et problem, der ofte opstår i analytisk kemi.

Alle i et laboratorium vil acceptere, at de målte signaler indeholder uundgåelige fejl, som typisk er tilfældige fejl. I henhold til reglerne for fejlformidling vil disse fejl sprede sig gennem de beregninger, der involverer både skæringspunkt og hældning. Dette betyder, at de beregnede værdier for a og b, som resultatet af mindste kvadraters metode, svarer til de mest sandsynlige værdier, vi kunne opnå under vores eksperimentelle forhold, hvis vi gentager forsøget mange gange. Disse værdier udgør gennemsnittene af deres respektive tilfældige fordelinger. Det er dog vigtigt at anerkende, at de sande værdier for a og b ikke nødvendigvis stemmer helt overens med de gennemsnitlige værdier. Det er nødvendigt at beregne konfidensintervallet for disse parametre, så vi kan være sikre på, hvor de sande værdier ligger. Her er Student’s t-test et nyttigt værktøj.

En standardkalibrering skal derfor udtrykkes korrekt som: y = (a±t·sa) + (b±t·sb)·x. Her er sa og sb de standardfejl, der er forbundet med skæringspunktet og hældningen, og t er t-værdien fra Student’s t-fordeling, beregnet med n−2 frihedsgrader og et givet konfidensniveau (ofte 95 %). På de fleste softwarepakker bliver sa og sb beregnet automatisk, mens lommeregnere ikke giver disse værdier direkte, men de kan beregnes nemt.

Endelig skal man forstå, at hvis skæringspunktet og hældningen er underlagt en Gaussisk fordeling, så vil enhver interpolation også være underlagt denne fordeling, på grund af fejlformidling. Derfor bør enhver interpoleret værdi gives med et tilhørende konfidensinterval.

Hvordan identificerer man forskellige kulbrinter og deres strukturer ved hjælp af IR-spektroskopi?

I IR-spektroskopi er det muligt at bestemme strukturen af forskellige kemiske forbindelser ved at analysere de specifikke vibrationer, der opstår, når molekyler interagerer med infrarødt lys. Disse vibrationer resulterer i spektrale peaks, som er karakteristiske for bestemte funktionelle grupper og strukturer. I denne kontekst er det vigtigt at forstå, hvordan man kan bruge IR-spektret til at identificere og differentiere forskellige typer kulbrinter og deres specifikke strukturelle egenskaber.

For eksempel viser et IR-spektrum en række interessante funktionelle grupper, der relaterer sig til strukturen af en given forbindelse. En markant peak ved 1375 cm−1 kan være forbundet med både symmetrisk og asymmetrisk CH-bøjningsvibration, hvor CH3-enheder og CH2-enheder giver oplysning om molekylets sammensætning. Det er også muligt at observere to nye spektrale peakinger omkring 1380 cm−1 og 1170 cm−1, hvilket tyder på, at der er tilstedeværelse af isopropyl- eller t-butylgrupper i molekylet. I dette tilfælde giver spektral splittingen ved 1380 cm−1 en klar indikation på en isopropylgruppe. For at bekræfte, hvilken af de to grupper der er til stede, skal man fokusere på området omkring 1150-1250 cm−1, hvor en tydelig peak ved 1170 cm−1 er synlig, hvilket indikerer tilstedeværelsen af en isopropylgruppe.

Når vi analyserer et spektrum, der potentielt kan være forbundet med enten propan eller propylen, skal man se på de specifikke bølgelængder, der er registreret. For eksempel viser en peak i området omkring 2950 cm−1, som er karakteristisk for CH3-grupper, samt en peak i området omkring 1450 cm−1, som kunne være et tegn på et asymmetrisk CH-bøjning. En nøje analyse af disse bands kan afsløre, om vi står over for propylen eller propan, som har forskellige strukturer.

I et andet eksempel, hvor en forbindelse med en molekylær masse på 70 g/mol vises i et IR-spektrum, kan vi bruge informationen fra de observerede bands til at udelukke tilstedeværelsen af dobbeltbindinger, hvilket indikerer, at forbindelsen ikke er en alken, men snarere en methylbuten, hvilket afsløres ved det karakteristiske 3100 cm−1-bånd, der indikerer tilstedeværelsen af en C=C-dobbeltbinding.

Spektrale data, som dem, der vises ved 2950–2975 cm−1 og 2850–2870 cm−1, afslører typisk CH-strækninger, som er en indikator for methyl- og methylenenheder i forbindelsen. Forbindelser med en lav molekylær vægt, såsom methylbuten, kan også identificeres ved at kigge på de specifikke bølgelængder, der svarer til C-H strækninger og bøjningsvibrationer. En peak ved 1600 cm−1, som normalt er forbundet med C=C-strækninger, bekræfter tilstedeværelsen af en dobbeltbinding i molekylet.

Det er også værd at bemærke, at et spektrum uden en klar peak omkring 1600 cm−1 kan indikere, at forbindelsen ikke indeholder en C=C-dobbeltbinding, hvilket giver os yderligere information om forbindelsens struktur.

Det er dog vigtigt at huske på, at IR-spektroskopi ikke altid giver et entydigt svar. Der er flere faktorer, der kan påvirke spektrenes udseende, såsom intermolekylære interaktioner, koncentration af forbindelsen og opløsningsmiddel, hvilket kan føre til ændringer i peakpositioner og intensitet. Derfor bør IR-spektroskopi anvendes sammen med andre analytiske teknikker, såsom massespektrometri eller NMR-spektroskopi, for at få en fuldstændig forståelse af molekylets struktur.

Hvordan opnå den bedste separation i kromatografi ved hjælp af selektivitet, retentionstid og peakbredde?

Når man arbejder med kromatografiske teknikker, er der flere faktorer, der spiller ind på kvaliteten af separationen af en blanding. En af de vigtigste faktorer er selektiviteten, som refererer til, hvordan de forskellige komponenter i blandingen adskilles i forhold til hinanden. Denne egenskab afhænger ofte af den valgte mobilfase, pH-værdi, og sammensætningen af bufferopløsningen.

Et centralt aspekt ved optimering af separationen i højtydende væskekromatografi (HPLC) er bufferens koncentration. Ved pH = 7 kan selektiviteten forbedres betydeligt ved at anvende en lavere koncentration af buffer. I sådanne tilfælde favoriserer selektiviteten lave procentdele acetonitril, især for parrene BZA-BZ og BZ-BZC. Dog viser BZ-TEBA-parret den bedste selektivitet, når der anvendes en høj procentdel acetonitril. Derfor bør de bedste betingelser for separationen være 45 % acetonitril, da dette giver den bedste afvejning mellem de tre par af peaks.

Det er dog vigtigt at forstå, at selektivitet og retentionfaktor kun giver en del af informationen om separationen. Når man har et system, hvor én forbindelse er meget mere koncentreret end de andre – som det er tilfældet med TEBA, der er den primære forbindelse i prøven – skal man også tage højde for peakbredderne. TEBA er den mest koncentrerede forbindelse i prøven, mens de andre forbindelser findes i sporadiske mængder. Derfor vil peakbredden for TEBA være væsentligt større end for de andre forbindelser, hvilket kan påvirke kvaliteten af separationen.

Når man beregner opløsningen mellem de nærliggende peaks under de specifikede betingelser, ses det, at der er stor forskel på opløsningen mellem de forskellige peaks. For eksempel har BZ-BZC-parret en meget højere opløsning (8,95) sammenlignet med BZA-BZ-parret (4,05). Dette betyder, at BZ-BZC-parret adskilles mere effektivt. På den anden side har BZ-TEBA-parret en betydeligt lavere opløsning (1,29), hvilket kan tilskrives den store peakbredde for TEBA, som kan gøre det sværere at opnå en god separation.

Når man arbejder med kromatografi, er det derfor ikke kun selektiviteten og retentionstiden, man bør fokusere på. Peakbredderne spiller også en vigtig rolle i vurderingen af, hvor effektiv separationen er. En stor peakbredde kan reducere opløsningen mellem peaks og dermed forringe kvaliteten af analysen.

Yderligere skal man også tage højde for det tekniske setup og de specifikke betingelser, der anvendes i analysen. For eksempel kan pH og koncentrationen af acetonitril i mobilfasen have stor indflydelse på både retentionstiden og selektiviteten. Disse faktorer kan justeres for at opnå den bedst mulige separation afhængigt af de specifikke mål for eksperimentet.