Одни авторы объясняют это более медленным распространением вирусов от клетки к клетке, так как в зоне верхушечной меристемы отсутствует проводящая система. Эта гипотеза основывается на экспериментально полученных данных, подтверждающих, что рост верхушки (апикальной меристемы) происходит гораздо быстрее, чем продвижение вируса.

Другие исследователи объясняют отсутствие вирусов особым метаболическим состоянием клеток меристемы, исключающим возможность размножения в них вирусов: высокой концентрацией ауксинов, отсутствием необходимых для этого ферментов и других соединений. В ряде случаев отсутствие вирусной инфекции объясняется тем, что на пути продвижения вирусов в меристематическую зону имеются механические преграды, связанные со слишком малыми размерами плазмодесм.

Минимальный размер участка апикальной ткани, из которого можно вырастить целое растение, у большинства сельскохозяйственных растений не превышает 100-200 мк (0,1-0,2 мм).

Между размерами вычленяемых меристем и эффективностью их оздоровления установлена прямая зависимость.

Чем меньше размер меристемы, тем ниже выход регенерируемых из них растений, но и тем выше вероятность получения освобожденных от вирусной инфекции регенератов. Меристемы меньшего размера с трудом поддаются культивированию, и процесс регенерации у них идет намного хуже.

Выбирая размер меристемного экспланта, надо оценивать возможности получить максимальное число растений при максимальном проценте безвирусных.

Чем больше размер меристематического экспланта, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого, нормального пробирочного растения.

Размеры же, зоны, свободной от вирусных частиц, очень различны для различных вирусов, а также зависят от сорта и вида растений.

Так, при вычленении апикальной меристемы картофеля величиной 0,2 мм среди полученных растений только 10% были свободны от X-вируca, но 70% от У-вируса картофеля.

Одни биотехнологи предпочитают использовать предельно малый размер экспланта (0,075-0,1 мм) и разрабатывают оптимальные условия для получения нормального пробирочного растения.

Другие предпочитают сочетать термотерапию и культуру меристем (предварительная термотерапия исходных растений обеспечивает оздоровление от вирусов при использовании эксплантов 0,3-0,8 мм, но приводит к отставанию в росте и деформации органов).

Работы по вычленению верхушечных меристем проводят в стерильных условиях. Меристемы отделяют от растения под бинокулярным микроскопом и переносят на агаризованные питательные среды или на маленькие кусочки фильтровальной бумаги, погруженные в питательный раствор.

Для каждой культуры эмпирическим путем составлены свои питательные среды. По достижении растениями-регенерантами определенной степени развития их из стерильных условий переносят в почвенный грунт и доращивают в теплицах или климатических камерах.

Регенеранты необходимо тестировать на наличие вирусов. Выход оздоровленных растений от числа эксплантированных меристем обычно бывает невысоким, нередко составляет всего 20-30%.

Химиотерапия. Для освобождения растений от вирусной инфекции в ряде случаев используют химические вещества - ингибиторы вирусов, которыми обрабатывают ростки растений перед вычленением меристем или добавляют их в питательную среду.

В качестве ингибиторов вирусов используют регуляторы роста нафтилуксусную кислоту (НУК), гиббереллин, индолилмасляную кислоту (ИУК), а также панкреатическую рибонуклеазу и другие ферменты.

В питательную среду добавляют «ворозол» (синтетический рибаварин - аналог гуанознна-1-Д-рибофуранозил-1,2,4-триазол-карбоксамида) в концентрации 40-200 мм, что увеличивает процент безвирусных меристемных растений до 80-100% при 0-41% в контроле.

Для повышения эффективности оздоровления исходного материала часто сочетают методы химиотерапии, термотерапии с методом верхушечных меристем.

В последнее время появилась возможность борьбы с вирусом томатов и огурцов в защищенном грунте с помощью вакцинации растений непатогенными вирусными штаммами, мутантами исходных патогенных.

Другой путь - получение непоражаемых вирусами сортов гибридизацией с устойчивыми дикими видами. С помощью генной инженерии созданы растения табака и томатов, устойчивые к ВТМ и вирусу мозаики люцерны. Однако о практическом использовании таких трансгенных растений говорить рано.

Пока же наиболее эффективным для создания безвирусного посадочного материала картофеля, винограда, плодовых, ягодных и других растении является способ культивирования меристем стебля или органов стеблевого происхождения, иногда дополненный термотерапией.

Микроклональное размножение

Получение растений, свободных от вирусной инфекции,- только первый шаг использования их в семеноводстве. Следующая важная задача - их ускоренное размножение. Кроме того сам по себе метод микроклонального размножения дает возможность получать в больших количествах растения у таких культур, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно, а также быстро размножить уникальный генотип, например, новый сорт.

Метод позволяет поддерживать на относительно небольшой площади в лабораторных условиях круглогодичный рост растений, что дает возможность планировать их выпуск к определенному сроку. Наконец, благодаря этому методу появилась реальная возможность создания «банка» или коллекции ценных культур.

В настоящее время существует несколько подходов к клональному микроразмножению растений в культуре ин витро:

1) получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза;

2) индукция развития побегов непосредственно из ткани эксплантата;

3) пролиферация пазушных побегов.

Эти способы имеют различные коэффициенты размножения, различную степень надежности в отношении сохранения генетической стабильности размножаемых форм растений, а также различаются универсальностью и повторяемостью получаемых результатов.

1) Размножение растений через каллусную и суспензионную культуру наиболее перспективно, так как здесь можно добиться максимального коэффициента размножения.

В 1 см3 суспензионной культуры или каллусной ткани содержится огромное количество клеток, каждая из которых является потенциальным растением.

Данный метод имеет следующие недостатки:

1. При культивировании каллуса и индукции органогенеза в клетках могут произойти структурные изменения хромосом, например анеуплоидия или полиплоидия, что увеличивает вероятность получения измененных, по сравнению с исходными, форм.

2. В настоящее время для большинства видов растений не удается создать условия для соматического эмбриогенеза, особенно для суспензионной культуры.

Через каллусную культуру удается размножать хризантему, гвоздики, землянику и некоторые другие растения. В целом метод можно было бы признать весьма эффективным (особенно если учесть то обстоятельство, что при культивировании ин витро каллусные ткани освобождаются от возбудителей вирусных заболеваний), если бы удалось найти достаточно простои способ отбора растений-регенерантов с неизмененным в результате культивирования геномом.

2) Формирование адвентивных почек и побегов Способность к индукции адвентивных почек в обычных условиях встречается у некоторых видов растений (например, в роде бегония), что используется для их размножения.

Условия культуры ин витро могут в сильной степени стимулировать этот процесс на цветной капусте.

Отмечена тенденция к развитию адвентивных побегов в присутствии повышенных концентраций цитокининов.

Главным преимуществом этого метода является сохранение при размножении всех признаков размножаемого образца. Однако полностью исключить возможность получения неоднородного потомства нельзя. Это связано с тем, что в тканях эксплантов могут встречаться клетки с измененным числом хромосом вследствие сомаклональной изменчивости.

И хотя вероятность появления растений-регеперантов из таких клеток очень мала, тем не менее ее нельзя не принимать во внимание, так как в условиях ин витро измененные формы могут неожиданно получить преимущество в развитии. Показана возможность размножения путем индукции побегов из ткани эксплантата таких культур, как цветная капуста, актинидия, земляника, некоторых цветочных культур.

3) Пролиферация пазушных побегов, основанная на снятии апикального доминирования. Этот метод уже стал промышленным при производстве посадочного материала некоторых культур. Эта модель впервые была отработана на землянике в начале 70-х годов. Снятие апикального доминирования может осуществляться двумя путями.

а) Получение побегов нормальных пропорций с последующим их делением на «однопочковые микрочеренки», которые используются в качестве вторичных эксплантов для повторения цикла размножения.

Теоретическая возможность такого способа составляет приблизительно 100 тыс.- 1 млн. побегов в год при условии, что за два месяца можно получить одни побег, дающий 10 «микрочеренков».

При работе с картофелем чаще всего пользуются черенкованием. Для этого выросший в пробирке из меристемы побег расчленяют с соблюдением стерильности на фрагменты размером 0,5-1,0 см, каждый из которых должен иметь листочек и пазушную почку.

Эти черенки сразу же помещают на питательную среду того же состава для доращивания и укоренения. При этом среда может быть как плотной (т. е. с агаром), так и жидкой. Как только высаженные черепки сформируют из пазушной почки новый побег, последний вновь черенкуют.

Таким образом, из ограниченного числа «меристемных» растений за несколько месяцев можно получить большое количество безвирусного посадочного материала (за полгода - 30000). При этом за каждый цикл черенкования оно возрастает и 4-5 раз. А после получения из черенков необходимого количества растений ин витро их пересаживают в зимние или весенне-летние теплицы, пленочио-марлевые изоляторы или открытый грунт.

б) Второй путь - снятие апикального доминирования путем введения в питательную среду веществ с цитокининовой активностью, что приводит к формированию побегов с относительно укороченными междоузлиями, а пазушные почки и меристематические бугорки дают начало новым побегам.

Экспланты на таких средах приобретают вид пучков маленьких побегов, каждый из которых может быть рекультивирован с тем же результатом. Теоретически, при условии получения 50 дополнительных почек в течение пассажа длительностью 2 месяца, возможность этого метода может составить до 15 млрд. почек или побегов в год от одного экспланта.

По мнению многих исследователей, способы размножения на основе снятия апикального доминирования имеют минимальную степень риска в отношении получения неоднородного потомства. Частота появления мутантных форм (в расчете на число новообразований) здесь не превышает частоту появления таковых при размножении растения обычными методами. Данный способ получает все большее распространение в практике. Он универсален и отличается относительно высокой воспроизводимостью полученных результатов.

Возможно снятие апикального доминирования веществами с цитокининовой активностью. Клубни картофеля получают из растений, выращенных в полевых условиях.

Клубень режут на кусочки размером 2,5 см, обрабатывают гиберреловой кислотой и инкубируют для стимуляции образования побегов. Меристемные ткани изолируют и пересаживают на среду без регуляторов роста. В течение месяца побеги увеличиваются в размерах и развиваются придаточные корни. Перенос побегов на среду, содержащую цитокинины, приводит к развитию пазушных почек. Растения-регенеранты с хорошо развитыми побегами и корнями можно переносить в почву или, перенеся их на среду, содержащую бензиламинопурин (БАП), вызвать образование миниатюрных клубней.

4) Дальнейшее размножение полученных из меристем растений картофеля можно производить также путем клубнеобразования.

Как показали специальные исследования, для этого пригодны только черенки из нижней части укороченного побега.

При этом процесс клубнеобразования стимулируется сокращением длины дня до 8 часов в сутки, введением в состав питательной среды вместо сахарозы глюкозы в концентрации 3% и понижением температуры.

Такой индуктивный режим необходимо выдержать в течение 12 суток, а затем для доращивания образовавшихся клубней пробирочные растения оставляют в условиях короткого дня, но температуру повышают до 18-20°С.

Преимущество этого способа состоит в том, что клубни можно длительно хранить без каких-либо дополнительных затрат труда, удобно при необходимости пересылать на большие расстояния.

Однако поскольку на каждом растении образуется всего лишь 1-2 микроклубня, а для клубнеобразования пригодны только нижние черенки, то коэффициент размножения при этом способе оказался не очень высоким. Поэтому он представляет практический интерес только для отдельных частных случаев, а в массовом безвирусном семеноводстве картофеля в основном используется метод черенкования.

Сейчас технологии клонального размножения ин внтро на лабораторном уровне разработаны в мире более чем для 2400 видов растений, однако потребности мирового рынка удовлетворяются не более чем на 20%. Основные недостатки клонального микроразмножения и оздоровления растений - большая трудоемкость и высокие затраты. Необходима автоматизация всех процессов, для чего нужна разработка принципиально новых приемов, среди которых можно назвать отказ от укоренения растений, привлечение для этого техники гидро - и аэропоники, регуляцию и стимуляцию процессов морфогенеза короткими световыми импульсами разного спектрального состава; применение полимеров, регулирующих водоснабжение растения согласно потребности.

Лекция 6. Криосохранение генофонда.

Важным вкладом в селекцию растений стала технология сохранения генофонда в культуре ин витро. Цель создания коллекций и банков клеток растений - обеспечение селекционера нужным для его работы генотипом. В любое время сохраняются редкие и исчезающие виды, сохраняются растения, размножающиеся как вегетативно, так и семенами (это особенно важно для поддержания гетерозисных гибридов, линий с ЦМС), таким образом сохраняются те уникальные генотипы, свойства которых были бы потеряны при половом размножении. Сохраняются также линии клеток и каллусов, синтезирующих ценные продукты вторичного метаболизма.

Криосохранение (от греч. «криос»- мороз) буквально означает хранение в замороженном состоянии. На практике это обычно хранение при очень низких температурах: при температуре сухого льда (-79°С), в морозильниках с ультранизкой температурой (-80°С и ниже), в парах (-140°С) или непосредственно в жидком азоте ( -196°С).

8.1. Криосохранение пыльцы и семян

Наиболее проста техника криосохранения пыльцы. Для этого подсушенную пыльцу помещают в запечатанные пластмассовые ампулы и переносят в жидкий азот. Криобанк пыльцы делает возможным скрещивание сортов растений, различающихся по времени цветения или же имеющих пыльцу с коротким периодом фертильности.

Успехи криоконсервиронания семян в значительной мере зависят от степени их влажности, верхней границей которой является 10-15%. Это связано с тем, что в достаточно сухих семенах вода является связанной, не способной замерзать. Как только при намачивании и набухании семян появляется свободная вода, в них образуется лед при замораживании, который приводит к механическим повреждениям клеток и к их гибели.

Установлено, что большинство видов растений имеют семена, которые можно легко высушить до низкой влажности (10-13% и ниже) без существенной потери их всхожести. Такие семена могут быть сохранены в жидком азоте путем прямого погружения после предварительного высушивания в вакууме. Однако существует нижний предел допустимой влажности 4-7%. При высушивании семян ниже 4° наблюдаются повреждения, связанные с аутоокислением липидов в меристематических зонах зародыша.

Относительно скорости оттаивания семян после их замораживания в литературе имеются расхождения. Так, для сои некоторые авторы считают более безопасным медленное оттаивание на воздухе при 0°С; другие же получили 80%-ное выживание семян сои при быстром погружении их в жидкий азот с последующим быстрым оттаиванием.

Быстрое оттаивание семян с хорошей степенью выживаемости было применено для 13 сортов картофеля после трехлетнего хранения в жидком азоте.

В настоящее время при глубинном замораживании семян используют методику японских исследователей Сакан и Ноширо (1975), которые рекомендуют высушивать семена до 8-15%, упаковывая их в пакеты из фольги или ампулы с плотными крышками, которые в дальнейшем погружаются прямо в жидкий азот, и после хранения постепенно размораживать их на воздухе. Однако семена других растений (такие тропические культуры, как кофе, какао, гевея) не могут прорастать, если их влажность снижается ниже 31-12% (в зависимости от вида). Какие-либо рекомендации по их криоконсервированию отсутствуют, однако в этом случае может оказаться полезным предыдущий опыт криоконсервирования. Так, (1960) удалось сохранить всхожесть ржи и пшеницы на уровне 71 % после замораживания в жидком азоте и даже жидком водороде (-253°С) набухших семян, содержащих 70-80% воды. Успех был достигнут благодаря постепенному еженедельному ступенчатому замораживанию семян путем понижения температуры в холодильных шкафах до -60°С с последующим их погружением в жидкий азот. Оттаивание проводилось в этих же шкафах с периодическим повышением температуры через каждые два дня. Предполагается, что при небольших скоростях охлаждения происходит перераспределение воды внутри семян и лёд образуется в эндосперме, вызывая обезвоженность зародыша и предотвращая тем самым его механические повреждения.

Помимо глубинного замораживания семян, возможно их хранение и при небольших пониженных температурах. В настоящее время имеются конкретные рекомендации для хранения семян. Так, например, для семян картофеля оптимальной пониженной температурой хранения является -14°С, для семян сорго -12°С. Однако такое хранение вряд ли целесообразно. Это связано с тем, что биохимические процессы при таких температурах не полностью подавлены; кроме того хранение семян в таких условиях требует дополнительной зашиты от высокой влажности и дополнительных мер предотвращения часто случающихся отказов механических систем охлаждения.

8.2. Криоконсервирование верхушечных, меристем клеток растений

Безусловно, хранение семян растений путем глубинного замораживания - наиболее простой и дешевый способ сохранения генетических ресурсов. Но многие растения размножаются только вегетативным путем (черенками, отводками, клубнями). На сегодняшний день для вегетативно размножающихся растений наилучшим способом сохранения их генофонда является криоконсервирование верхушечных меристем побегов. Следует отметить, что данный способ может оказаться единственно пригодным для долгосрочного хранения растений с так называемыми «неподдающимися» семенами, так как обладает большим преимуществом по сравнению с другими объектами, культивируемыми в данных условиях. Это объясняется прежде всего тем, что меристемы после криосохранения сразу развиваются в целое растение, т. е. в данном случае нет необходимости проводить дополнительные процедуры, связанные с регенерацией растений. Клетки меристемных растений всегда однородны по плоидности, и регенерируемые из них растения соответствуют исходному генотипу, этим обеспечивается большая генетическая стабильность. Кроме того, меристемные клетки растений очень мелкие, почти невакуолизированы, а связи с этим они намного легче переносят глубокое замораживание и оттаивание. Подвергая криоконсервированию меристемы, можно не только сохранить данный генотип, но и получить впоследствии путем микроклонального размножения необходимое количество растений.

Значительно сложнее стоит проблема криоконсервации клеток растений. Наибольшие трудности здесь связаны с процессом замораживания, так как клетки растении имеют свою специфику. Они обладают большими размерами, сильной вакуолизацией, обилием воды и чрезвычайной шпротой и пластичностью их метаболизма, поскольку находятся в значительно более изменчивых условиях, чем, например, клетки животных. В этой связи выживаемость клеток растений даже в лучших (редких) случаях не превышает 69-70%.

В течение многих лет для сохранения исходных культур использовалось постоянное выращивание растений при оптимальных условиях. Но при этом существует риск возникновения сомаклональной изменчивости, загрязнения чужеродным генетическим материалом, случайной утери собственного генетического материала. К тому же для поддержания культуры тканей обычно требуются регулярные пересадки на свежую питательную среду через каждые 2-4 недели, что оказывается довольно трудоемким и дорогостоящим процессом. В настоящее время существуют два основных подхода к хранению культур замедленный рост коллекции и криосохранение.

а) Замедленный рост коллекции. Для замедления роста большинства культур необходимы факторы, ограничивающие рост. Наиболее часто используется снижение температуры культивирования. Поместив коллекции в условия низких температур (1-10°С в зависимости от холодостойкости вида растений), период без пересадок можно удлинить до 6-24 месяцев.

Рост растений можно задержать добавлением к питательной среде соединений, способных замедлять рост (ретарданты). Они могут оказать осмотическое действие (маннит) или быть веществами гормональной природы (абсцизовая кислота). Еще один способ - изменение состава атмосферного воздуха, с которым соприкасается культура, чаще всего снижение в нем содержания кислорода (гипоксия), например, выращивание в атмосфере, состоящей из смеси азота (90%) и кислорода (10%). Кроме того, задержку роста можно вызвать, снижая атмосферное давление до 0,014 мм ртутного столба или комбинируя пониженное давление и гипоксию.

Обычное время хранения культур с ограниченным ростом составляет около года. Снижение скорости роста ниже некоторой точки приводит к гибели культуры. Таким образом, если полностью отказаться от пересаживания культуры, необходимо использовать такой способ хранения, при котором происходит полная остановка метаболизма.

б) Криосохранение. Главное преимущество хранения при очень низких температурах состоит в значительном замедлении и даже остановке метаболизма и биологического разрушения. Благодаря этому более совершенному и широко используемому способу сохраняются мутантные, гибридные, трансформированные, способные к морфогенезу клетки: меристемы и кончики побегов, зиготические и соматические зародыши, пыльца, семена, в том числе не выносящие обезвоживания, причем в течение любого срока. Кроме того, хорошо отлаженное криосохранение менее трудоемко, чем поддержание и хранение коллекции. К настоящему времени разработаны условия криосохранення культур клеток примерно 30 видов растений.

Успех низкотемпературного криоконсервирования зависит от целого ряда факторов: генетических и морфологических особенностей клеток, состава среды консервирования, вида и концентрации криопротектора, режима охлаждения и условий оттаивания, способности к закаливанию и уровня проницаемости криопротектора.

Рассмотрим процессы, происходящие в клетке при охлаждении. Точка замерзания чистой воды 0°С, но ее можно охладить до более низких температур (вплоть до -38°С), при этом льда не образуется. Такая вода называется переохлажденной. Снизить точку замерзания можно добавлением растворяющихся веществ, например хлорида натрия, или криопротекторов (глицерин, диметилсульфоксид, полиэтиленгликоль).

При охлаждении водного раствора происходит постепенное образование чистого льда. В результате постепенного удаления из раствора воды (за счет перехода ее в лед) все растворенное вещества концентрируются в оставшемся растворе, вследствие чего заметно снижается его температура замерзания. По мере дальнейшего охлаждения вода из раствора будет продолжать удаляться до тех пор, пока, наконец, не будет достигнута температура плавления, при которой и этот концентрированный раствор твердеет.

Как клеточная стенка, так и плазматическая мембрана выступают в качестве барьеров для роста льда. Так как цитоплазма клетки по отношению к внеклеточной среде изначально гипертонична, то лед сначала образуется вне клетки. Внеклеточные растворы становятся концентрированными, и осмотический градиент через мембрану клетки меняет свое направление. В результате клетки начинают терять воду, постепенно обезвоживаясь, а растворы внутри клетки становятся более концентрированными, что является одной из главных причин повреждения клеток в процессе охлаждения (осмотический стресс). Другой причиной является образование внутриклеточного льда. Опасен рост центров кристаллизации в крупные кристаллы (более 0,1 мкм), чьи грани разрушают мембраны. Полностью рост и перестройка кристаллов льда прекращается в чистой воде только при температуре около -140°С. Вот почему длительное уверенное хранение возможно только при низких температурах. Таким образом, повреждении клеток при замораживании и последующем оттаивании зависит, с одной стороны, от образования льда внутри них (механический стресс), а с другой - от их обезвоживания (осмотический стресс).

При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, что приводит к обезвоживанию и повреждениям клеток до того, как будет достигнута температура замерзания цитоплазмы. Быстрое охлаждение вызывает более раннее замораживание клеток изнутри и меньшее обезвоживание; повреждения клеток вызываются при этом образующимися внутри клеток кристаллами льда.

В криосохранении используют метод двуступенчатого охлаждения, который заключается в предварительном замораживании клеток быстрым охлаждением до температуры ниже нуля и кратковременном выдерживании их при этой температуре перед быстрым охлаждением до температуры хранения. Прерывание быстрого охлаждения и выдерживание в течение определенного времени при температуре, выше критической, вызывает сжатие клеток, в результате чего клетки становятся способными пережить охлаждение и оттаивание. Высокие концентрации внеклеточных растворов, создающиеся во время периода предварительного охлаждения, по-видимому, обеспечивают сжатие, достаточное для защиты клеток от повреждения. Оптимальная температура и продолжительность периода предварительного замораживания зависят от типа клеток и связаны с кинетикой движения воды через клеточную мембрану. На этом этапе в среду добавляют криопротекторы - вещества, которые уменьшают повреждения клеток от осмотического и механического стресса при замораживании и оттаивании, изменяют проницаемость клеток и температуру замерзания. Это вызвано снижением количества образовавшегося льда и, следовательно, концентрации других растворенных веществ. Криопротекторами являются либо проникающие в клетки вещества- диметилсульфоксид (ДМСО) и глицерин, либо не проникающие высокомолекулярные- поливинил, пиролидон, декстран, полиэтиленгликоль. Наиболее часто используют ДМСО - или один, или с добавлением сахарозы, глицерина.

Большое значение для успеха криосохранения имеет режим замораживания на этапе от 0° до -40°С, который может быть медленным (со скоростью 0,5-1°С в минуту) или сверхбыстрым (от 50° и более чем 1000°С в минуту до непосредственного погружения в жидкий азот объектов размером до 0,5 мм).

Хотя для наиболее мелких и устойчивых клеток (например, моркови) допустимы скорости замораживания 1-4°С/мин, для более крупных и вакуолизированных, к которым относится подавляющее большинство культивируемых ин витро клеток растений, рекомендуемая скорость 0,5°С/мин, а для самых больших и клеток апексов еще меньшие скорости.

Криоконсервация культур растений во многих случаях начинается с этапа специальной подготовки, хотя существуют культуры, которые достаточно просто брать для замораживания в начале или в середине экспоненциальной фазы роста, когда они обогащены меристемоидными клетками в результате интенсивных делений. Один из способов предварительного культивирования - добавление в среду маннита или сорбита в концентрации 2-6% на период от нескольких суток до 2-3 пассажей. Такой способ уменьшал размер клеток и, что важнее, их вакуолей.

При втором способе предкультивирования используют аминокислоты и среди них в первую очередь пролин, чье значение для связывания воды в клетке широко известно. Его концентрацию постепенно поднимали для ряда клеток до 1 М (11,5%) на срок до 4 суток (большой период предкультивирования приводил к дегенеративным изменениям в клетках). Кроме пролина используют низкие концентрации аланина, серина и аспарагина в течение 4-6 суток; наилучшие результаты были получены с аспарагином. В результате в клетках уменьшается количество зерен крахмала и их размеры и увеличивается (примерно в 2 раза) содержание сахаров. Повышается и выживание клеток после оттаивания.

Третий способ предварительного культивирования применяли вначале только для апексов побегов - плотных организованных структур без межклетников, размером около 500 мкм.

Проникновение во внутренние клетки апексов даже легкопроникающего ДМСО и их образование затруднены. ДМСО добавляли в концентрации от 2,5 до 10% (чаще 5% на срок до 48 часов).

Четвертый способ осуществляется в условиях искусственного закаливания к холоду, он применим только к зимующим растениям умеренного климата. Суть закаливания сводится к имитации естественного осеннего процесса подготовки растений к периоду зимнего покоя. При работе с клеточными суспензионными или каллусными культурами обычно их (так же как и растения) или сразу помещают в условия с температурой от 2 до 5°С на срок от 1 до 6 недель, или сначала в течение нескольких суток выдерживают при температуре 8-10°С. Более эффективно закаливание в присутствии сахарозы (до 12-15%).

После подготовки перед добавлением криопротекторов клеточные суспензии концентрируют. Поскольку центрифугирование (даже в течение 5 мин. при 100 g) повреждает многие растительные клетки, то применяют осаждение в цилиндре или прямо в колбе, которые устанавливают в сосуд со льдом. Длительность осаждения 15-30 мин в зависимости от размера клеток и их агрегатов. Небольшие агрегаты с мелкими наиболее жизнеспособными и устойчивыми клетками оседают последними. После осаждения надосадочную жидкость отсасывают.

Замороженные культуры необходимо хранить при низкой температуре, по крайней мере, при -100°С. На практике для этого удобнее всего использовать жидкий азот (-196°) или его пары (-150°С).

При слишком медленном оттаивании клеток в них происходит повторное образование льда, оказывающее повреждающее действие. Поэтому предпочтительнее использовать быстрое оттаивание. Для этого ампулы встряхивают в воде с температурой 40°, иногда 60°С. Но как только начинает исчезать последний кристаллик льда в ампуле, ее переносят в сосуд со льдом.

Отмывание от криопротектора применяется только в случае использования веществ, токсичных для данных клеток. Содержимое ампулы разбавляют в 3-4 приема с 15-мипутпыми интервалами большим объемом холодной питательной среды или 3-15%-ной сахарозы. Повышенная концентрация сахарозы полезна для замедления деплазмолиза, если криопротектор вызвал плазмолиз. Затем клетки отстаивают, а надосадочную жидкость заменяют питательной средой, объем которой приблизительно равен исходному объему суспензии. Возобновление роста культур требует 2-3 недель.

Лекция 7. Генная инженерия в растениеводстве.

Предмет генной инженерии - осуществление трансгеноза (переноса генов). Трансгеноз осуществляется в четыре этапа:

1) получение нужного гена;

2) его встраивание в вектор (молекулы ДНК, способные переносить включенные в них чужеродные гены в клетку, где они реплицируются);

3) введение гена в составе вектора в организм;

4) идентификация клеток, которые приобрели желаемый ген.

1. Получение генов

Получить нужный ген можно:

а) выделением его из ДНК;

б) путем химико-ферментативного синтеза;

в) воссозданием нл основе информационной РНК с помощью фермента РНК-завн-симон ДНК-иолимеразы (ревертазы).

а) Выделение гена из ДНК. Изолированную ДНК разрезают на фрагменты с помощью ферментов - рестрикционных эпдонуклеаз (рестриктаз), которые узнают определенные последовательности нуклеотидов (обычно длиной в 4-6 нуклеотидных пар). К настоящему времени известно более 400 рестриктаз, которые узнают 85 вариантов различных последовательностей.

Расщепление может происходить по середине узнаваемого участка, и тогда обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне - образующиеся фрагменты имеют двунитевые (тупые) концы. Другие рестриктазы расщепляют нити ДНК со сдвигом, так что образуется ступенька - одна из нитей ДНК выступает на несколько нуклеотидов. Образуются однонитевые (липкие) концы. Если встречаются два липких фрагмента ДНК., полученных действием одной и той же рестриктазы, то в силу комплементарности концевых последовательностей они легко взаимодействуют и при участии фермента лигазы сшиваются:

Однако часто трудно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, который соответствует нужному гену (кроме нужного участка включаются липкие последовательности или, наоборот, отщепляются части нуклеотдной последовательности гена, в результате чего ген становится функционально неполноценным).

б) Химико-ферментативный синтез гена. Синтезируются короткие (8-16-звенные) одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), которые затем сшиваются между собой с помощью фермента лигазы с образованием двухценочечных полинуклеотидов. Для .химико-ферментативного синтеза генов необходима информация о первичной структуре: соответствующего белка. Таким способом уже получены гены соматостатина и инсулина.

в) Синтез гена на основе выделенной из клетки информационной РНК. Это наиболее распространенный метод.. Обратная траискриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной иРНК. Полученную одноцепочечпую ДНК, называемую комплементарной ДНК (кДНК), используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с применением ДНК-полимеразы или ревертазы. Таким способом в 1979 г. был получен ген гормона роста человека (соматотропин).

2. Введение гена в вектор

Векторы - это кольцевые молекулы ДНК, способные к самостоятельной репликации. Вектор с включенным в него геном образует так называемую рекомбинантную ДНК.

Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется ин витро. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Необходимо, чтобы полученная линейная молекула ДНК содержала липкие концы, такие же, как концы вводимого гена. Комплементарные липкие концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой, и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой молекулы.

В качестве векторов наибольшее применение в генетическом инженерии нашли бактериальные плазмиды, особенно плазмиды кишечной палочки, а в генной инженерии растений плазмиды бактерий Агробактериум тумефациенс и Агробакгериум ризогенез. Агробактериум тумефациенс содержит так называемые Ti-плазмиды, Т-участок ДНК плазмиды может встраиваться в геном растений (крестоцветные, злаки). Ti-плазмиды содержат три гена (онкогены), два из которых кодируют стадии синтеза ауксина, а третий отвечает за синтез цитокинина. В отличие от роста нормальных клеток, который регулируется поступлением ауксинов и цитокининов, рост клеток, содержащих Т-участок Ti-плазмиды, бесконтролен, что приводит к образованию наростов-опухолей. Плазмиды могут быть «обезоружены» вырезанием у них онкогенов. Вставка в Т-участок гена, кодирующего нужный нам белок, ведет к превращению Ti-плазмид в очень полезный вектор для трансгеноза. Агробактериум ризогенез содержит Ri-плазмиды которые можно использовать аналогичным образом.

3. Перенос гена в клетки организма-реципиента

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4